Біологічні науки / 5 Молекулярна біологія

Панасюк І.В.

Національний університет харчових технологій, Україна

Марченко С.В.

Інститут молекулярної біології і генетики ім. Д.К. Заболотного НАН України, Україна.

Застосування потенціометричного біосенсора на основі рекомбінантної уреази для визначення сечовини в крові.

Вступ

Сечовина [CO(NH2)2] – органічна молекула, що широко розповсюджена в природі. Простий підрахунок показує, що тільки людська популяція на Землі щодоби виділяє до 200 000 тонн сечовини. Однак, сечовина, яка надходить в навколишнє середовище швидко метаболізується під дією уреази ґрунтових бактерій з утворенням аміаку і диоксиду вуглецю. Продукти гідролізу сечовини асимілюються рослинами. В природі існує баланс між продукцією (тварини, мікроорганізми) та гідролізом (мікроорганізми) сечовини [1].

Аналіз концентрації сечовини у різноманітних зразках є необхідним для потреб медицини, агро-харчової промисловості і при моніторингу навколишнього середовища [1]. В медичній лабораторній діагностиці визначення рівня сечовини є одним із важливих рутинних тестів, оскільки сечовина – це кінцевий продукт обміну білків і головний азотний компонент сечі, що продукується печінкою і виводиться нирками. При деяких патологічних станах, таких як ниркова недостатність, гіперпірексія, гіпертиреоїдизм, лейкемія, діарея, цукровий діабет концентрація сечовини виходить за діапазон норми, яка становить 2,5 – 7,5 мМ в крові та 10 – 30 г в сечі, зібраній протягом доби. Крім того, високий рівень сечовини в крові може бути спричинений хронічною чи гострою нирковою недостатністю (50-70 мМ та 120-150 мМ, відповідно), непрохідністю сечовивідних шляхів, зневодненням, шоковим станом та кровотечею шлунково-кишкового тракту. Такі патологічні рівні сечовини можна знизити до 10 мМ за рахунок гемодіалізу чи перитоніального діалізу (рівень сечовини у діалізаті може варіювати від 3 до 16 мМ). Зниження рівня сечовини може викликатися печінковою недостатністю, нефротичним синдромом та кахексією [2].

Сучасні клінічні лабораторії для діагностування рівня сечовини в основному використовують прямі спектроскопічні методи, які залежать від попередньої обробки зразків, довготривалі в часі і не можуть застосовуватись для real-time визначення сечовини. Розщеплення сечовини до амонію та диоксиду вуглецю проводиться ферментом уреаза:

(NH2)2CO + 2H2O + H+ →2NH4+ + HCO3-

Внаслідок реакції, зменшується концентрація іонів водню (підвищується рН) та продукуються два нові іони. Тому даний фермент може бути використаним для створення багатьох типів уреазних біосенсорів, таких як потенціометричні

Матеріали і методи

В роботі використовували фермент уреазу (КФ 3.5.1.5), що продукувалась в E. coli, з активністю 150 од.акт./мг виробництва фірми “Usbiological” (США). Для порівняння була використана уреаза фірми Fluka. Сироватковий альбумін бика (БСА, фракція V) та сечовина були отримані від фірми „Sigma-Aldrich Chemie” (Німеччина); PVA-SbQ – від фірми Toyo Gosei Kogyo Co.Ltd (Японія). Робочим буферним розчином був фосфатний буфер (КH2РО4-NаОН), рН 7.4 фірми "Helicon” (Москва, Росія). Інші неорганічні сполуки, що використовувались були аналітично чисті.

В даній роботі використовувались електрохімічні та біохімічні методи дослідження ферментативних реакцій, потенціометричний метод, методи ковалентної іммобілізації ферментів, прямі хімічні та ферментативні методи з колориметричною детекцією, статистичний та кореляційний аналіз.           

 

 

Результати та обговорення

Метою першого етапу роботи було дослідити аналітичні характеристики біосенсора на основі рекомбінантної уреази при визначенні концентрації сечовини в модельних розчинах. Швидкість відгуків біосенсора при додаванні сечовини складала 1-2 хв., час відмивки (час регенерації біосенсора) робочим буфером – 1 хв. Лінійний діапазон визначення сечовини був 0.5-15 мМ (R = 0.99), операційний діапазон – 0.5-40 мМ. Даного лінійного діапазону було цілком достатньо для роботи з реальними зразками при розведенні в 10 разів. Для порівняння, за такою самою методикою був створений біосенсор на основі звичайної уреази, отриманої із бобів сої. Він характеризувався лінійним діапазоном 0.02-0.16 мМ, насичення було при концентрації сечовини 2 мМ (Рис. 1).

Рис 1. Калібрувальна крива визначення сечовини. Біосенсор на основі уреази з бобів сої(1) і рекомбінантної(2). Досліди проводились у 5 мМ фосфатному буфері, pH 7.4, при кімнатній температурі.

Значне розширення лінійного діапазону у випадку біосенсора на основі рекомбінантої уреази пов’язане з підвищеною до 200 мМ константою Міхаеліса-Ментен (Кm) даного ферменту. Як відомо, не модифікована уреаза має Кm в районі 3-8 мМ. Оскільки Кm є показником афінності ферменту до субстрату, рекомбінантна уреаза має меншу спорідненість до сечовини і меншу швидкість каталізу (це призводить до того, що максимальний відгук біосенсора на основі рекомбінантної уреази менший у порівнянні з відгуком біосенсора на основі звичайної уреази). Підвищення Кm в рекомбінантної уреази пов’язане з заміною в її активному центрі гістидину 219 з на інший амінокислотний залишок. Як наслідок, біосенсори на основі такої уреази будуть характеризуватися зменшенням чутливості до сечовини і більшим лінійним діапазоном.

Розбіжність відгуків біосенсора при безперервній роботі становила 3-5% (R.S.D. для 10 послідовних відгуків).

Іонна сила розчину, в якому проводяться вимірювання, є важливим параметром для роботи біосенсора. Тому було досліджено, як змінюються відгуки біосенсорів на сечовину (5 мМ) при різних концентраціях NaCl в робочому буфері. За концентрації NaCl 0 - 25 мМ, змін відгуків не спостерігалось; при збільшенні концентрації до 150 мМ спостерігалося падіння сигналу на 40% від початкового. Подальше збільшення концентрації хлориду натрію до 200 мМ призводило до зміни сигналу лише на 1 %. Таким чином, принципово можливо визначати сечовину навіть у нерозведених зразках діалізату та сироватки крові, однак це буде супроводжуватись зменшенням чутливості біосенсора та погіршенням точності аналізу.

Наступним етапом дослідження було визначення вмісту сечовини в зразках сироватки крові. Для визначення концентрації сечовини в пробах було застосовано класичний біосенсорний метод за калібрувальною кривою.

Процедура визначення невідомої концентрації сечовини в реальних зразках полягала в наступному. До електрохімічної комірки об’ємом 1,5 мл додавали відому концентрацію сечовини (для перевірки стабільності біосенсора), а потім, після відмивки, - 150 мкл сироватки крові, з врахуванням загального об’єму комірки, що призводило до кінцевого розведення зразку в 10 разів. За величиною відгуку, отриманого на пробу реального зразку та калібрувальною кривою оцінювали вміст сечовини.

Таким чином було визначено невідому концентрацію сечовини в 10 пробах сироватки крові. В Табл. 1 представлено результати аналізу, отримані за допомогою розробленого біосенсора та двох контрольних методів –  ферментної системи уреаза/пероксидаза та диацетилмонооксимної реакції. Принцип диацетилмонооксимної реакції полягає в тому, що сечовина в присутності тіосемикарбазиду та солей тривалентного заліза утворює комплекс з диацетилмонооксимом, інтенсивність забарвлення якого прямо пропорційна вмісту сечовини в досліджуваному біозразку. Видно, що краще корелюють дані, отримані за допомогою біосенсора та ферментної системи уреаза/пероксидаза (R = 0,97), що може бути пов’язаним із тим, що в основі обох методів лежали ферментативні реакції. У випадку ж хімічного аналізу на основі диацетилмонооксимної реакції основним недоліком є світлочутливість комплексу, який утворюється, і впливає на результати аналізу, про що і може свідчити коефіцієнт кореляції R=0,73.

Розбіжність відгуків біосенсора при багаторазовому додаванні однієї проби була така сама, як і при додаванні модельного розчину сечовини – 3-5% ((R.S.D. для 10 відгуків).

 

Номер зразку

Метод визначення

Біосенсор

Система уреаза/пероксидаза

Диацетилмоноксимна реакція

1

33,9

27

30,7

2

34

27,5

34,5

3

31,7

34,1

47,4

4

41

39,3

33,1

5

27,4

31,5

42

6

49,2

47,1

36,7

7

30

28,5

34,5

8

43,2

42,9

34,5

9

34,22

31,4

36,7

10

31,12

29,7

34,5

 

Таблиця 1. Результати визначення сечовини в зразках сироватки крові, отриманих за допомогою біосенсора на основі рекомбінантної уреази та двох контрольних методів.

Висновки

В роботі розроблено біосенсор на основі рН-чутливих польових транзисторів і рекомбінантної уреази. Показано значне розширення лінійного діапазону визначення сечовини внаслідок застосування рекомбінантного ферменту у порівнянні з біосенсором на основі не модифікованої уреази. Це дає змогу проводити вимірювання зразків, що містять велику концентрацію сечовини, без значного їх розведення. Показано відсутність значного впливу компонентів плазми крові та діалізату на роботу біосенсора. За допомогою розробленого біосенсора проведено кількісний аналіз концентрації сечовини в 10 зразках сироватки крові хворих на ниркову недостатність і показано високу кореляцію результатів із контрольними методами визначення сечовини – ферментною системою уреаза/пероксидаза та диацетилмоноксимною реакцією.

Література:

1.      Differential type solid-state urea biosensor based on ion-selective electrodes / N.H. Chou, J.C. Chou, T.P. Sun, S.K. Hsiung Sensor and Actuators B.-130.-P.359-366. (2008).

2.    T. Ahuja, D. Kumar, N. Singh, A.M. Biradar, Rajesh / Potentiometric urea biosensor based on multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs)/silica composite material // Material science and Engineering C .- 2011.-V.31.-P. 90 – 94.