магистрант Кусымбаева С. К.
Костанайский
государственный университет, Казахстан
Значимость ПЦР в режиме R-time при диагностики септориоза злаковых культур
Злаковые культуры остаются главным среди других
сельскохозяйственных растений в странах Центральной Азии, в том числе и в
Казахстане. По данным ФАО в 2013 году данный регион характеризуются самым высоким уровнем потребления пшеницы на душу
населения – более 200 кг в год. Поэтому, зерновые культуры играют значительную
роль в обеспечении продовольственной безопасности стран региона. Более того Казахстан является основным
экспортером пшеницы, что повышает требования к качеству зерна. При производстве пшеницы в регионе
фермеры сталкиваются со многими трудностями, среди которых наиболее опасным
является значительное распространение болезней, наносящие существенный ущерб
урожаю зерна [1].
Согласно Постановлению Правительства
Республики Казахстан от 10 декабря 2002 года № 1295 «Об утверждении перечней
карантинных объектов и особо опасных вредных организмов» в
«Перечень особо опасных вредителей и болезней сельскохозяйственных
растений» был включен септориоз зерновых культур [2]. Данное заболевание считается не только широко
распространенным практически во всех странах, занимающихся выращиванием
злаковых культур, а также является причиной огромного снижения их
урожайности. Резко-континентальный
климат Казахстана, особенно в его северных регионах благоприятствуют развитию и
распространению септориоза, снижая рентабельность зернового производства. Снижение биологической продуктивности
растений происходит, когда данное грибковое заболевание поражает верхние листья
злаковых растений, а также их колосья в период молочной и молочно-восковой
спелости. Поражение колосьев и верхних ярусов листьев злаковых культур грибами
рода Septoria вызывает значительную потерю урожайности (составляет почти 50%
при эпифитотиях) [3].
Для
организации рациональной системы защиты урожая, прогнозирования развития
болезни, правильного выбора фунгицидов, сроков и доз их применения, при
принятии решения о необходимости предпосевной обработки ими семян, а также при
выведении устойчивых сортов необходима точная видовая идентификация
возбудителей септориоза. Однако первые признаки поражения грибами рода Septoria
на листьях злаковых проявляются через
достаточно длительный период времени, пока возбудитель септориоза проходит свой
инкубационный период, а значит, диагностировать наличие заболевания визуально
невозможно.
Визуальная
диагностика заболевания затруднена присутствием в пределах одного поля и даже
одного растения нескольких видов рода Septoria. Определение по морфологии
плодовых тел и конидий осложняется присутствием похожих образований других
грибов, а после формирования пикнид применение фунгицидов уже не дает нужного
эффекта. Традиционные методы комплексной диагностики, включающие выделение
видов в чистую культуру, подбор сред и условий культивирования, получение
моноспоровых изолятов и микроскопия, длительны, трудоемки и недостаточно
эффективны. Следовательно, необходимы наиболее оптимальные методы, для
своевременной диагностики заболевания на ранних стадиях его развития.
Существует ряд биотических и абиотических
заболеваний с идентичными признаками проявления. Для улучшения качества
экспертизы необходимо внедрение
современных методов диагностики септориоза.
В начале 1990-х годов был
создан новый метод детекции ампликонов в режиме реального времени (Real-Time
PCR), благодаря которому появилась возможность корректного определения
количества исходной ДНК-мишени в пробе.
Применение полимеразной цепной
реакции (ПЦР) в модификации Real-Time для
лабораторной диагностики привело к революционному развитию группы
диагностических методов, основанных на выявлении генетического материала.
Общий принцип ПЦР основан на
многократном увеличении (амплификации) числа копий целевого специфического
фрагмента ДНК (ДНК-мишени или матрицы) ферментом ДНК-полимеразой. Для синтеза
новых комплиментарных цепей ДНК-полимераза использует в качестве затравки
синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды (праймеры). Реакцию проводят в
условиях многократного (25.50 раз) повторения температурного цикла,
включающего 3 основных этапа (табл. 1).
Таблица 1
|
Основные
этапы ПЦР в режиме R-time |
|
|
Денатурация |
разогрев реакционной смеси до высокой температуры (обычно 94.95°С), при которой диссоциируют все комплексы ДНК, в том числе расплетается и двойная спираль ДНК-мишени |
|
Отжиг праймеров, или гибридизация |
смесь охлаждается до температуры, при которой праймеры образуют двуцепочечный комплекс с ДНК-мишенью |
|
Элонгация |
удлинение цепей ДНК, приводящее к удвоению ДНК-полимеразой специфического фрагмента ДНК |
При отсутствии факторов,
препятствующих эффективной амплификации, за один цикл количество копий
специфического участка ДНК-мишени (ампликонов) увеличивается вдвое, а после 30
циклов. Более чем в 109 раз. Благодаря этому ПЦР нашла применение в
лабораторной диагностике для определения настолько малых количеств патогенных
микроорганизмов, надежное выявление которых без амплификации невозможно.
Теоретически при помощи ПЦР можно обнаружить единичную молекулу ДНК-мишени. На
практике для достоверного анализа необходимо присутствие в пробирке с
реакционной смесью нескольких десятков копий специфической ДНК.
В современной лабораторной
диагностике Real-Time PCR активно внедряется в качестве - метода выявления
специфических фрагментов генетического материала патогенных микроорганизмов и
постепенно вытесняет варианты ПЦР с детекцией продуктов амплификации по
окончании реакции. Принципиальным преимуществом является возможность
осуществления детекции накопления ампликонов без открывания пробирки, что
минимизирует риск получения ложноположительных результатов из-за контаминации
проб и реагентов продуктами амплификации. Существенное уменьшение количества
манипуляций с исследуемым образцом сокращает затраты времени, упрощает анализ и
позволяет снизить вероятность ошибок. Применение наряду с праймерами
гибридизационных зондов обеспечивает повышение специфичности анализа.
Возможность независимой одновременной регистрации флуоресцентного сигнала от
нескольких гибридизационных ДНК-зондов допускает выявление в одном исследовании
нескольких различных участков одной или различных ДНК-мишеней. Но главная
особенность Real-Time PCR, позволившая этой методике занять особое место среди методов
лабораторной диагностики, – возможность определения исходного количества копий
специфической ДНК-мишени в клинической пробе.
По сравнению с традиционными способами видовой
детекции, установление видовой принадлежности растительного сырья при помощи
ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем видовой дифференциации,
высокой воспроизводимостью и возможностью количественного анализа.
Таким образом, в Казахстане диагностика септориоза злаковых культур
по методу ПЦР активно исследуется и будет предложена внедрению ее в
производство.
Литература:
1.
Койшибаев М., Исмаилова Э.Т. Особенности развития и вредоносность септориоза
пшеницы в Казахстане. / Вестник с.-х. науки Казахстана. 1991, № 11. С. 31-36.
2.
Перечень с изменениями, внесенными постановлением Правительства РК от
23.11.2005 N 1157.
3. И. М. Поляков, Е. М. Шумаков, статья «Защита растений» Большая советская
энциклопедия. — М.: Советская энциклопедия. 1969—1978.;