Биологические науки/10. Генетика и цитология

К.б.н. Малышева И.Е., К.б.н. Топчиева Л.В., Рахимбаева Н.У., К.м.н Барышева О.Ю., Васькова О.А.

ИБ КарНЦ РАН, Россия; ПетрГУ, Россия

Исследование уровня экспрессии мРНК генов каспаз при ревматоидном артрите.

При аутоиммунных патологиях различного генеза, к числу которых относится и ревматоидный артрит (РА) установлено нарушение программируемой клеточной гибели (ПКГ) (Eguchi, 2001). Неотъемлемыми участниками процессов апоптоза являются клеточные каспазы (аспартат-зависимые протеазы). Однако в условиях нарушения ПКГ процессы синтеза и активности указанных ферментов могут изменяться. В тоже время данные литературы о роли каспаз в патогенезе РА являются весьма противоречивыми. В связи с этим цель настоящего исследования заключалась в изучении на уровне мРНК экспрессии генов каспаз 3, 6 и 9 в лейкоцитах периферической крови больных ревматоидным артритом.

В исследование было включено 17 пациентов с диагнозом РА (ср. возраст - 54±13) и 20 доноров контрольной группы (ср. возраст - 47,7±13,3). Материалом служили пробы периферической крови, полученные в условиях Отделения Ревматологии Республиканской больницы г. Петрозаводска. Диагноз Ревматоидный Артрит (РА) соответствовал критериям Американской коллегии ревматологов (ACR) 1987 г. Забор венозной крови осуществлялся утром натощак. Тотальную РНК выделяли с помощью набора AxyPrep Multisource Total RNA Miniprep Kit (Axygen). кДНК синтезировали с помощью набора для обратной транскрипции (Синтол). Относительный уровень экспрессии генов оценивали с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени на приборе iCycler c оптической приставкой iQ5 (Bio-Rad). В качестве референсного гена использовали ген GAPDH. Статистический анализ полученных данных проведен при помощи пакета программ Statgraphics 2.1. Достоверными считали различия при уровне значимости p<0,05. Критерий Вилкоксона-Манна–Уитни применяли для сравнения показателей в группе больных и группе контроля.

Установлено, что уровень экспрессии мРНК гена каспазы 3 в лейкоцитах периферической крови больных РА в 1,6 раза был выше чем у доноров контрольной группы (p<0,05). Аналогичные данные по изменению уровня экспрессии гена эффекторной каспазы 3 получены в работе Четиной и соавт. (Четина и др., 2012). При анализе уровня экспрессии мРНК генов каспазы 6 и каспазы 9 не было выявлено статистически значимых различий у больных РА по сравнению с контролем.

Мы сравнили относительный уровень экспрессии мРНК генов каспаз 3, 6 и 9 в крови доноров контрольной группы и больных РА в зависимости от пола. Достоверные различия по экспрессии мРНК генов каспаз 6 и 9 наблюдались между мужчинами и женщинами в контрольной группе (p<0,05). В лейкоцитах крови женщин содержание этих транскриптов оказалось соответственно в 1,5 и 1,2 раза выше, чем у мужчин (p<0,05). В группе больных РА значимых различий по уровню экспрессии мРНК исследуемых генов между мужчинами и женщинами установлено не было. Нами было обнаружено, что уровень экспрессии мРНК эффекторной каспазы 6 в крови мужчин контрольной группы в 2 раза ниже, чем у мужчин с диагнозом РА (p<0,05). При сравнении уровня экспрессии мРНК гена инициирующей каспазы 9 в лейкоцитах крови женщин было установлено, что он достоверно ниже у больных РА, по сравнению с этими показателями в контрольной группе (p<0,05).

В ходе проведенного нами корреляционного анализа (по Спирмену) была установлена значимая положительная корреляция между уровнем экспрессии мРНК гена каспазы 6 и гена каспазы 9 в крови доноров контрольной группы (коэффициент корреляции составил 0, 69 при p<0,05). В группе больных РА наблюдалась положительная умеренная корреляция между уровнем экспрессии мРНК гена каспазы 6 и гена каспазы 3, а также гена каспазы 6 и гена каспазы 9 (p>0,05).

Нами также проведен регрессионный анализ, который позволил выявить, что в группе больных РА коэффициент детерминации низкий и составил 0,125. Напротив, в контрольной группе данный показатель оказался достаточно высоким (0,56 при p<0,01). Эти данные позволяют предположить, что у больных РА, повышение транскрипционной активности гена каспазы 6 скорее всего обусловлено не увеличением уровня транскриптов гена каспазы 9, а включением альтернативных сигнальных путей.

Таким образом, развитие ревматоидного артрита может сопровождаться усилением транскрипционной активности гена эффекторной каспазы 3. Тем не менее увеличение транскриптов этого гена может не сопровождаться активацией процесса ПКГ. О нарушении процесса апоптоза при РА могут свидетельствовать данные регрессионного анализа.

Литература:

1. Четина Е.В., Семенова Л.А., Логунов А.Л., Коломацкий В.В., Макаров М.А., Роскидайло А.А., Нарышкин Е.А., Макаров С.А. Повышенная экспрессия регуляторных генов в крови и суставном хряще больных ревматоидным артритом // Научно-практическая ревматология. 2012. Т.53. № 4. С. 44-48.

2. Eguchi K. Apoptosis in autoimmune diseases // Intern. Med. 2001. V.40. P. 275-284.

3. Fairweather D., Frisancho-Kiss S., Rose N.R. Sex Differences in Autoimmune Disease from a Pathological Perspective // The American Journal of Pathology. 2008. Vol. 173. N 3. P. 600-609.