К.мед. н. Маракушин Д.И., д.мед.н. Наконечная О.А., Закирова С.В.

Харьковский национальный медицинский университет

ВЛИЯНИЕ «НЕОНОЛОВ» НА СТРУКТУРНО – МЕТАБОЛИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ПЕЧЕНИ И СИСТЕМУ ДЕТОКСИКАЦИИ В ПОДОСТРОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Интесивное развитие химической, нефтеперерабатывающей, фармацевтической, металлургической, машиностроительной промышленности использование в производстве и быту большого ассортимента химических средств, создают реальную угрозу глобального загрязнения среды обитания человека. Существуют многочисленные примеры интенсивного загрязнения населенных мест и снижения общей популяционной резистентности, свидетельствующих о вреде, который может быть нанесен здоровью в условиях антропогенного воздействия химических веществ и их бесконтрольного использования. Основными химическими загрязнителями в последние 20-30 лет стали нефтехимические, нефтеперерабатывающие, металлургические комбинаты и предприятия химической промышленности органического синтеза, объем и ассортимент продукции которых постоянно увеличивается, что создает реальную угрозу здоровью населения [1-3]. Возросшая химическая нагрузка на биосферу и человека диктует необходимость оперативного выявления нарушений гомеостатической функции организма на ранних этапах развития предболезни. Методологической основой при этом может быть разработка экспресс-тестов для установления ранних признаков молекулярной мембранной патологии, которая лежит в основе формирования экологически обусловленных манифестных признаков болезни. В связи с этим, актуальным является изучение патофизиологических механизмов развития структурно-метаболических нарушений, которые лежат в основе возникновения патологических состояний, сопряженных с кризисным состоянием биосферы [4-6]. Значительное число химических соединений обладает мембранотропным действием, вызывает развитие молекулярной свободнорадикальной патологии, подавляет иммунитет, оказывает мутагенное, эмбриотропное, гонадотропное и тератогенное действие. При этом патофизиологические механизмы их развития остаются практически неизученными, а для новой группы детергентов, на основе алкилфенолов, они совершенно не изучены.

Интерес к натриевым солям карбоксиметилированного этоксилата (КЭ) на основе соответствующих изононилфенолов обусловлен большими объемами производства, широким ассортиментом продукции, значительным контактом населения и отсутствием прогностической оценки потенциальной опасности данных соединений для теплокровных животных и человека [3].

Целью работы явилось изучение влияния группы поверхностно-активных веществ в подостром токсикологическом эксперименте на структурно-метабо-лическое состояние печени и обоснование информативных показателей ее дисфункции.

Материалы и методы исследования. В работе были использованы натриевые соли КЭ на основе соответствующих изононилфенолов, имеющих товарное название „неонолы” марок АФС9-4 КМ, АФС9-6 КМ, АФС9-10 КМ с регламентированными физико-химическими свойствами. Влияние веществ на структурно-метаболическое состояние печени, как главной детоксифицирующей лаборатории, изучалось в условиях подострого токсикологического опыта на белых крысах популяции WAG. Половозрелые животные массой 190-210г подвергались ежедневному пероральному воздействию ксенобиотиков на протяжении 45 суток. Для этого водные растворы «неонолов» в дозах: 1/10, 1/100, и 1/1000 ДЛ₅₀ утром до кормления с помощью металлического зонда вводились внутрижелудочно. Контрольная группа получала соответствующие объемы питьевой воды. На основании результатов острого эксперимента исследуемые детергенты относятся к малотоксичным и умеренно токсичным соединениям, обладающим выраженными кумулятивными свойствами. Среднесмертельные дозы (ДЛ₅₀) были установлены на уровнях: 6,1; 2,2; и 3,2 г/кг массы животного и коэффициенты кумуляции на уровнях: 3,16; 2,72; и 2,39, соответственно для АФС 9-4 КМ, АФС9-6 КМ, АФС9-10 КМ. Все этапы научного эксперимента выполнялись в соответствии с правилами гуманного отношения к животным и требованиями «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в научном эксперименте» (г.Страсбург, 1986).

Программа исследования предусматривала изучение влияния детергентов на детоксикационную функцию печени по следующим показателям: активность глюкуронидной, глутатионовой, сульфатной и ацетильной конъюгации, состояние системы оксидантно-актиоксидантного гомеостаза и динамических изменений уровней белкового, углеводного, нуклеинового и жирового обменов. Так, содержание кетоновых тел в крови крыс определяли путем связывания ацетона салициловым методом [6]. Неэтерифицированные свободные жирные кислоты определяли по экстракции медных солей жирных кислот в плазме крови органическими растворителями [7]. Гликоген в печени определяли метедом Зейфтера [8]. Активность УДФ-глюкуронилтрансферазы микросомальной фракции печени оценивалась по скорости конъюгации паранитрофенола [9-11], N-ацетилтрансферазы в постмитохондриальной фракции – по скорости конъюгации парааминобензойной кислоты, количество которой измеряли по реакции диазосоединения с N-нафтилэтилендиамином [12]. Активность глутатион-S-трансферазы оценивалась по образованию конъюгатов глутатиона с 1-хлор-2,4-динитробензолом [13,14]. Суммарное содержание КоА определяли методом ацетилирования пара-аминобензойной кислоты [14]. Содержание восстановленного и окисленного глутатиона определяли в глутатион-трансферазной реакции [15]. Цистеин определяли по реакции с нингидрином в трихлоруксусном фильтрате [16]. Суммарную PHК выделяли фенольно-термическим методом [17]. Ядра из печени белых крыс выделяли по методу D.М.Gill [18], глобулины определяли по методу Б.И. Збарского и Г.П. Георгиева [19], гистоны – по методу E.W. Johns, A.V. Butter [20]. Об относительном уровне вторичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по накоплению малонового диальдегида (МДА), который определяли по Ю.А. Владимирову и А.И. Арчакову [21]. Диеновые конъюгаты (ДК) определяли спектрофотометрическим методом, который основан на характерном их поглощении в ультрафиолетовой области спектра 233 нм [22]. Холестерин, глюкозу, креатинин, мочевину, АсАТ, АлАТ, Т-2,3-ДО определяли общепринятыми методами [8, 9]. Глюкозо-6-фосфатаза определялась в печени по методу, описанному А.А. Покровским и А.И. Арчаковым [23]. Для статистической оценки групповых различий использовали параметрический t-критерий Стьюдента-Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение. Изучение влияния «неоно-лов» в 1/10; 1/100 ДЛ₅₀ выявило нарушение структурно-метаболического состояния функции печени и антиоксидантной защиты опытных животных подвергавшихся токсификации АФС9-4 КМ, АФС9-6 КМ и АФС9-10 КМ на фоне дисфункции обмена липидов, белков, углеводов и нуклеиновых кислот. Вещества в 1/1000 ДЛ₅₀ не оказывали влияние на метаболические показатели в условиях подострого опыта и эта доза была определена как недействующая.

Исследование глюкуронилтрансферазной активности в микросомах гепатоцитов обнаружило при воздействии 1/100 ДЛ₅₀ снижение активности фермента на 38,2%; 32,4% и 42,65%, общих глюкуронидов - на 30%; 25,8% и 35,1%, связанных глюкуронидов - на 46,1%; 39,9% и 50,6%, свободных глюкуронидов - на 22,7%; 20% и 27,5%, соответственно в условиях подострого воздействия АФС9-4 КМ, АФС9-6 КМ и АФС9-10 КМ (табл.1). Эти данные свидетельствуют о том, что неонолы способны ингибировать фазу конъюгации чужеродных химических соединений.

Анализ влияния «неонолов» на активность образования сульфатной и ацетильной конъюгаций выявил значительное ингибирование арилсульфо-трансферазы и увеличение активности N-ацетилтрансферазы (табл.2). Так «неонолы» в 1/100 ДЛ50 подавляли активность арилсульфотрансферазы на: 44,7%; 36,85%; 52,6%; и снижали содержание в печени общих сульфатов на: 37,2%; 36,5%; и 41,2%, свободных сульфатов: 66,6%; 55,5%; и 88,8%, связанных сульфатов на: 56,7%; 53,4%; 58,4%, соответственно под воздействием АФС9-4 КМ, АФС9-6 КМ и АФС9-10 КМ. Активность N-ацетилтрансферазы под влиянием 1/100 ДЛ50 повышалась на: 64,1%; 52,0%; и 80,0%, а содержание общего КоА на: 218,1%; 212,8%; 230,1%, соответственно при воздействии АФС 9-4 КМ, АФС 9-6 КМ и АФС 9-10 КМ.

Таблица 1. Активность УДФ-глюкуронилтрансферазы в микросомах гепатоцитов и содержание глюкуронидов в печени белых крыс под влиянием неонолов в 1/100 ДЛ₅₀.

Показатели	Вещества, М±m
	Контроль	АФС9-4 КМ	АФС9-6 КМ	АФС9-10 КМ
УДФ-глюкуронил-трансфераза (нмоль/мин ∙мг белка)	3,40 ± 0,27	2,10 ± 0,14*	2,30 ± 0,22*	1,95 ± 0,16*
Общие глюкурониды (мкмоль/г)	90,4 ± 6,2	64,7 ± 3,8*	67,5 ± 4,2*	58,7 ± 3,6*
Связанные глюкурониды(мкмоль/г)	47,4 ± 3,8	25,6 ± 2,3*	28,4 ± 1,37*	23,4 ± 1,5*
Свободные глюкурониды(мкмоль/г)	43,6 ± 4,2	33,7 ± 2,8*	36,1 ± 2,4*	31,6 ± 2,1*

Примечание: *- различия достоверные, Р<0,05.

Таблица 2. Активность арилсульфотрансферазы и N-ацетилтрансферазы в постмитохондриальной фракции и содержание сульфатов и КоА в печени под влиянием неонолов в 1/100 ДЛ₅₀.

Показатели	Вещества, М±m
	Контроль	АФС9-4 КМ	АФС9-6 КМ	АФС 9-10 КМ
Арилсульфотрансфераза (нмоль/мин на мг белка)	0,38 ± 0,014	0,21 ± 0,013*	0,24 ± 0,016*	0,18 ± 0,015*
Общие сульфаты (мкмоль/г)	1,48 ± 0,05	0,93 ± 0,07*	0,94 ± 0,08*	0,87 ± 0,05*
Свободные сульфаты (мкмоль/г)	0,27 0,02	0,45 ± 0,02*	0,42 ± 0,03	0,51 ± 0,04*
Связанные сульфаты (мкмоль/г)	1,20 ± 0,04	0,52 ± 0,06*	0,56 ± 0,04*	0,50 ± 0,03*
N-ацетилтрансфераза (нмоль/мг белка/60 мин)	0,25 ± 0,018	0,41 ± 0,03*	0,38 ± 0,02*	0,45 ± 0,02*
Общее содержание КоА (нмоль/г печени)	286,2 ± 13,7	910,3 ± 37,8*	895,4 ± 43,5*	944,6 ± 35,4*

Примечание: *- различия достоверные р < 0,05.

Определение активности глутатион-S-трансферазы в постмитохондриаль-ной фракции печени и содержания глутатиона и цистеина в печени выявило значительное ингибирование фермента и снижение содержания восстановленного глутатиона и цистеина на фоне повышения глутатиондисульфида (табл.3). Эти данные свидетельствуют о том, что «неонолы» в 1/100 ДЛ₅₀ ингибируют образование глутатионовой конъюгации и антиоксидантную способность тканей печени. Вещества снижали активность глутатион-S-трансферазы на 59,3%; 54,3% и 64,2%, содержание глутатиона восстановленного - на 42,3%; 33,8% и 45,8%, и цистеина - на 28,6%; 21,4% и 42,85% при увеличении окисленного глутатиона на 184,3%; 165,6% и 203,1%, соответственно в условиях воздействия АФС9-4 КМ, АФС9-6 КМ и АФС9-10 КМ.

Таблица 3.Активность глутатион-S-трансферазы (нмоль/мин на мг белка) в постмитохондриальной фракции печени и содержание глутатиона и цистеина (мкмоль/г) в печени под влиянием неонолов в 1/100 ДЛ₅₀

Показатели	Вещества, М±m
	Контроль	АФС9-4 КМ	АФС9-6 КМ	АФС9-10 КМ
Глутатион-S-трансфераза	38,5 ± 2,53	15,7 ± 0,94*	17,6 ± 1,3*	13,8 ± 1,4*
Восстановленный глутатион	7,10 ± 0,62	4,10 ± 0,37*	4,56 ± 0,52*	3,85 ± 0,42*
Глутатион дисульфид	0,32 ± 0,02	0,91 ± 0,06*	0,85 ± 0,07*	0,97 ± 0,06*
Цистеин	0,28 ± 0,01	0,20 ± 0,005*	0,22 ±0,008*	0,16 ± 0,004*

Примечание: *- различия достоверные, Р < 0,05.

На фоне ингибирования глюкуронидной, сульфатной и глутатионовой конъюгации, ксенобиотики в 1/100 ДЛ₅₀ повышали в печени содержание МДА и ДК. В крови под влиянием этой дозы отмечалось повышение содержания креатинина, мочевины, свободных жирных кислот, кетоновых тел, холестерина и активности ферментов АлАТ и АсАТ (табл.4). Исследования показали повышение содержания МДА на 122,4%; 115,5% и 180,5%, ДК - на 74,3%; 61,5% и 91,5%, креатинина - на 56,6%; 55,5% и 62,6%, мочевины - на 120%; 148% и 162,8%, свободных жирных кислот - на 95,4%; 118,5% и 143%, кетоновых тел - на 385,2%; 441,2% и 517,6%, холестерина - на 100%; 91,5% и 107,7%, АлАТ - на 382,4%; 356,1% и 408,7%; АсАТ - на 330,5%; 293% и 380,5%, соответственно под влиянием АФС9-4 КМ, АФС9-6 КМ и АФС9-10 КМ. Эти данные показывают, что неонолы в 1/100 ДЛ₅₀ стимулируют перекисное окисление липидов, накапливают кетоновые тела, активируют распад белков и жиров, что свидетельствует о преобладании катаболических процессов над анаболическими синтезами. Вместе с тем установлено снижение в печени содержания гликогена, рибонуклеиновых кислот, глобулинов, гистонов и снижение активности ферментов: глюкозо-6-фосфатазы и триптофан-2,3-диоксигеназы, а в крови - снижение уровня глюкозы. Так, наблюдалось снижение гликогена на 76%; 73,2% и 79%, РНК - на 47%; 41,2% и 53,7%, глобулинов - на 34,75%; 29% и 24,6%, гистонов - на 39,4%; 35,75% и 47,3%, глюкозы - на 46,6%; 38% и 50,87%, глюкозо-6-фосфатазы - на 63,5%; 62,2% и 74,75%, Т-2,3-ДО - на 61,5%; 56,6% и 60,6% (табл.4), что указывает на ингибирование восстановительных синтезов и нарушение углеводного и нуклеинового обмена.

Таблица 4.Влияние „неонолов”на состояние мониторинговых показателей в подостром опыте под воздействием 1/100 ДЛ₅₀

Показатели, ткань	Вещества, М±m
	Контроль	АФС9-4 КМ	АФС9-6 КМ	АФС9-10 КМ
МДА(нмоль/ на мг белка),микросомальная фракция печени.	9,15±0,86	20,35±1,63*	19,72±1,45*	25,67±1,58*
ДК (нмоль/ мг белка),микросомальная фракция печени	38,73±2,45	67,52±3,68*	62,56±3,82*	74,18±9,66*
Креатинин (мкмоль/л), сыворотка	69,2±4,17	108,4±5,10*	107,6±4,30*	112,5±6,20*
Мочевина (ммоль/л), кровь	5,16±0,32	11,35±0,67*	12,8±0,74*	13,56±0,87*
Гликоген (мкмоль глюкозы/г печени)	135,8±8,70	32,6±2,8*	36,4±3,1*	27,30±3,40*
РНК(имп/мин·мг РНК) печень	26847,5±876,3	14253,7±425,6*	15783,6±540,8*	12428,3±475,6*
Глобулины(имп/мин·мг белка)ядерная фракция печени	195,4±15,8	127,5±6,4*	138,7±5,3*	147,4±6,8*
Гистоны(имп/мин·мг белка)ядерная фракция печени	240,6±17,3	145,8±6,3*	154,6±7,2*	125,3±5,4*
Свободные жирные кислоты (ммоль/л), сыворотка	0,65±0,08	1,27±0,06*	1,42±0,09*	1,58±0,12*
Кетоновые тела(ммоль/л), сыворотка	0,34±0,017	1,65±0,07*	1,84±0,08*	2,10±0,14*
Глюкоза(ммоль/л), кровь	5,80±0,23	3,1±0,25*	3,60±0,27*	2,85±0,16*
Глюкозо-6-фосфатаза (нмоль/мин на мг белка), микросомы печени	9,42±0,77	3,44±0,27*	3,56±0,32*	2,38±0,22*
Холестерин (ммоль/л), сыворотка	1,42±0,13	2,84±0,22*	2,72±0,18*	2,95±0,27*
АлАТ (мкмоль/л·час), сыворотка	0,57±0,06	2,75±0,26*	2,6±0,24*	2,9±0,31*
АсАТ(мкмоль/л·час), сыворотка	0,72±0,05	3,10±0,28*	2,83±0,32*	3,46±0,42*
Триптофан-2,3-диоксигеназа(нмоль кинуренина/мг белка·1час) микросомы печени	12,2±0,96	4,7±0,44*	5,3±0,65*	4,8±0,54*

Примечание: *- различия достоверные р < 0,05.

Выводы. Результаты исследования свидетельствуют, что «неонолы» марок АФС9-4 КМ, АФС9-6 КМ и АФС9-10 КМ под воздействием 1/100 ДЛ₅₀ угнетают в печени образование глюкуронидной, сульфатной и глутатионовой конъюгации на фоне активирования ацетильной, что указывает на дисфункцию системы детоксикации ксенобиотиков. Исследуемые вещества способны стимулировать свободнорадикальные процессы, перекисное окисление липидов и подавлять систему антирадикальной защиты на фоне нарушения белкового, углеводного, жирового и нуклеинового обмена с превалированием катаболических процессов над анаболическими синтезами в 1/100 ДЛ₅₀. Анализ показывает, что «неонолы» обладают политропным характером действия, в основе которого лежит мембранная патология. Наиболее информативными и критериально значимыми показателями дисфункции печени являлись продукты ПОЛ (МДА, ДК), субстраты системы антирадикальной защиты (восстановленный и окисленный глутатион) и активность органоспецифических ферментов (АсАТ и АлАТ), которые отражали напряжение систем адаптации под воздействием 1/100 ДЛ₅₀.

Литература.

1.Щербань Н.Г. Биохимические механизмы радиомиметических эффектов поверхностно-активных веществ / Н.Г. Щербань, В.И. Жуков, В.В. Мясоедов [и др.]. – Харьков: «Раритеты Украины», 2012. - 120 с.

2.Жуков В.И. Фториды: биологическая роль и механизм действия / В.И.Жуков, О.В.Зайцева, В.И. Пивень [и др.]. – Белгород, 2006. - 220 с.

3.Цыганенко А.Я. Научные основы обоснования прогноза потенциальной опасности детергентов в связи с регламентацией в воде водоёмов / А.Я. Цыганенко, В.И. Жуков, Н.Г. Щербань [и др.]. – Белгород, 2001.- 442 с.

4.Жуков В.И. Простые и макроциклические эфиры: научные основы охраны водных объектов / В.И. Жуков, Л.Д. Попова, О.В. Зайцева [и др.]. – Харьков, «Торнадо», 2000.- 438 с.

5.Жуков В.И. Медико-биологические аспекты проблемы охраны водных объе ктов от загрязнения поверхностно-активными веществами / В.И. Жуков, Р.И. Кратенко, Ю.К. Резуненко [и др.]. – Харьков, «Торнадо», 2000. - 394 с.

6.Жуков В.И.. Детергенты – модуляторы радиомиметических эффектов / В.И. Жуков, В.В. Мясоедов, Ю.И. Козин [и др.]. – Белгород, 2000. - 376 с.

7.Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике / А.А.Покровский . - М.: Медицина, 1969.- 652 с.

8.Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / Под. ред. проф. В.В. Меншикова. – М.: Медицина, 1987.-368 с.

9.Асатиани В.С. Биохимическая фотометрия / В.С. Асатиани. – М.: Издательство академии наук СССР, 1957. - 836 с.

10. Burchell B. 4-Nitrophenol UDP-glucoronyltransferase / B. Burchell, P. Weatheril // Meth. Enzymol. – 1981.-Vol. 77. - P. 169-171.

11. Cummings J. Kinetics of microsomal glucuronidation in intact and perturbattreated membranes / J. Cummings, A.B.Graham, G.C. Wood // Biochim. Biophys. Acta. – 1984, - Vol. 771, №2. – P. 127-141.

12.Weber W.W. N-acetyltransferese and Arylhydroxamic Acid acyltransferese / W.W. Weber, G.M. King // Meth. Enzymol. – 1981. – Vol. 77. – P. 272-281.

13.Habig W.H. Assays for differentiation of glutathone-S-tranferase / W.H. Habig, W.B. Jacobi // Meth. Enzymol. - 1981.- Vol. 77. - P. 398-405.

14.Экспериментальная витаминология // Под. ред. Ю.М. Островского. – Минск: Наука и техника. – 1979. – 550 с.

15.Asaoka K. An enzymatic assay of reduced glutathione using glutathione-S-aryltransferase with O-dinitrobenzene as a substrate / K. Asaoka, K. Takashi // J. Biochem. - 1981. –V. 90, №5. – P. 1237-1242.

16.Gaitonde M.K. A spectrophotometric method for direkt determination of cysteine, in the presense jf other naturally occuring aminoasid / M.K. Gaitonde // Biochem. J.- 1967.- Vol. 104. - №2.- P.627-633.

17.Георгиев Г.П. Информационная и рибосомальная рибонуклеиновые кислоты хромосомно-ядрышкового аппарата, методы разделения и нуклеиновый состав / Г.П. Георгиев, В.П. Мантьева // Биохимия.- 1962.- Т.27. - С. 949-957.

18.Gill D.M. Аn improved method for isolation of rat liver nuclei by dengity centrifugation / D.M. Gill // J.Cell. Biologi.- 1965. – Vol.24.-p.157-161.

19.Збарский Б.И. Новые данные по функционированию клеточных ядер печени крыс и химическому составу ядерных структур / Б.И. Збарский, Г.П. Георгиев // Биохимия.- 1959.- Т.24, Вып. 2.-С. 192-199.

20.Jong E.V., Butter A.V. Father fractionariong of histones from calf thymus / E.V. Jong, Butter A.V. // Biochemical Journal.- 1962.- vol.82, №1.- p.15-18.

21.Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Медицина, 1972.- 236 с.

22. Косухин А.Б. Экстракция липидов смесью гептан-изопропанол для определения диеновых конъюгатов / А.Б. Косухин, Б.С. Ахметова // Лаб. дело. - 1987. - №5. - С. 335-337.

23. Покровский А.А. Методы разделения и ферментной идентификации субклеточных фракций / А.А. Покровский, А.И. Арчаков // Современные методы в биохимии.- М.: Медицина, 1968.- С.5-59.