Кургамбаева Г

Кургамбаева Г.С., к.в.н. Бабак В.А., к.б.н. Тен О.А., к.х.н. Балпанов Д.С.

Филиал РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан», КН МОН РК в г. Степногорск, e-mail: ipbncbrk@mail.ru

Суспензионное культивирование линии клеток

ВНК-21(cl-13)

Суспензионный метод культивирования клеток и вирусов наиболее пригоден для получения вируссодержащего материала в промышленных объемах. Данный метод культивирования позволяет стандартизировать процессы культивирования, снизить расход питательных сред и повысить производительность труда. Целью наших исследований являлось отработка параметров глубинного суспензионного культивирования клеток ВНК-21(cl-13) в различных режимах при переходе от роллерного метода накопления клеточной биомассы к суспензионному культивированию.

На базе лаборатории вирусных препаратов были отработаны схемы культивирования в ручном, автоматическом и смешанных режимах в соответствии с настройками биоферментера BiostatB 10L – МО. Для первичного накопления клеточного материала отработана и построена технологическая схема выращивания клеток в режимах периодического культивирования (batch), культивирования клеток с подпиткой (fed-batch), в режиме культивирования с осаждением клеточной культуры и сменой ростовой питательной среды на поддерживающую.

Оптимальные параметры периодического режима суспензионного культивирования клеток ВНК-21(сl–13) в биореакторе BiostatB 10L – МО составили: температура питательной среды + 36,6–37,0^оС, комбинированный тип мешалки биореактора (лопастная + винтовая), влияющий на параметры и условия перемешивания, режим аэрации атмосферным воздухом – 0,5–2 объема/ч (9–18 % растворенного кислорода), показатель концентрации водородных ионов среды (рН) – 6,9–7,3, посевная концентрация клеток – 0,5–1,0 млн.кл/мл, уровень пенообразования в биореакторе до 1 см на поверхности. Аэрацию суспензии клеток начинали через 2,0 часа после загрузки – период адаптации культуры клеток, необходимый для установления газового равновесия, накопления СО₂ и снижения рН суспензии до значения 7,2–7,3. При выполнении экспериментов в биореакторе с датчиком растворенного кислорода корректировку режима аэрации уточняли по показателю DO₂. При отборе проб для оценки качества перемешивания проводили подсчет клеток по общепринятой методике в камере Горяева, при этом оценивали не только количество выросших клеток в зависимости от изменения того или иного параметра культивирования, но и наличие конгломератов и мертвых клеток. Выход клеток при таком режиме культивирования через 48–72 часа культивирования составлял 2,2–2,8 млн.кл./мл (n=7), жизнеспособность 98%, ИПА 4,4-5,6.

Серия исследований была направлена на отработку параметров суспензионного глубинного культивирования клеток ВНК-21(сl–13) в режиме продленного культивирования с подпиткой (fed-batch). На первом этапе выращивания данные роста клеток соответствовали кривым роста, полученным при периодическом культивировании – получали двукратный прирост в период 14-20 часов – и к 48-60 часам получали 1,65-2,1 млн.кл/мл (n=3), жизнеспособность 99%. Все клетки оставались жизнеспособными, при подсчете конгломераты отсутствовали, в камере Горяева просматривались делящиеся клетки с правильной морфологией. На втором этапе закачивали 2,5 литра ростовой питательной среды и продолжали накопление клеток, при этом получали 0,82-1,05 млн.кл/мл (n=3), жизнеспособность 98%, после чего устанавливали скорректированные на объем загрузки (5,0 л) и концентрацию клеток новые параметры культивирования и продолжали накопление клеток. Пик накопления клеток приходился на 48-60 часов от внесения первой порции подпитки, при этом получали 2,1-3,2 млн.кл/мл (n=3), жизнеспособность 98%, морфология правильная. На третьем этапе докачивали 2,5 литра питательной среды. Накопление клеток составило 3,0-4,3 млн.кл/мл, жизнеспособность 97%.

Были изучены параметры суспензионного глубинного культивирования клеток ВНК-21(сl–13) с осаждением клеточной культуры и сменой ростовой питательной среды по технологии режима периодического культивирования. Накопление клеток проводили 72 часа до максимального накопления клеточной суспензии, при этом получали выходы 2,1-2,7 млн.кл/мл (n=3). Через 14-16 ч. без перемешивания проводили декантирование надосадка питательной среды, после чего компенсировали питательную среду свежей порцией и начинали новый цикл периодического культивирования. После периода адаптации и установления газового равновесия задали начальные оптимальные параметры по режиму периодического культивирования: температура +36,9^оС, перемешивание 150 об/мин, аэрация 6,5 л/ч, режим автоматической коррекции рН – 7,05±0,1, DO2 – 10%, пеногашение в ручном режиме один раз в сутки. Культивирование проводили в течение 48 часов. В связи с большой концентрацией клеток показатель рН быстро смешался в кислую сторону, что требовало значительного внесения 7,5% раствора бикарбоната натрия. С учетом высокой концентрации клеток внесли также поправку на перемешивание (до 200-220 об/мин), аэрацию (12-14 л/ч) и DO2 – 12-14%. Выход клеток через 2-е суток составил 3,7-4,8 млн.кл/мл (n=3), жизнеспособность 97%, клетки правильной морфологии, что свидетельствует о достаточно высоких результатах проведенных экспериментов.

Литература:

1. Автоматический биореактор ферментер «BioFlo 110 Fermenter/Bioreactor» [Электронный ресурс] / Продукция компании NBS. – 2007. – Режим доступа: http://www.nbsc.com/category_productDetail.aspx? cat_id=4&p_id=38 – Дата доступа: 22.03.2007.

2. Адамс, Р.М. Методы культуры клеток для биохимиков / Р.М. Адамс. – М.: Мир, 1983. – 263 с.

3. Блажевич, О.В. Культивирование клеток: Курс лекций / О.В. Блажевич. Мн.: БГУ, 2005. – 78 с.

4. Культивирование клеток и тканей животных / Л.П. Дьяконов [и др.]; под общ. ред. Л.П. Дьяконовa – Ставрополь: Ставроп. Правда, 1988. – Ч. 2. – 91 с.

5. Культуры животных клеток // Культивирование клеток // Системы культивирования клеток [Электронный ресурс] / Основы биотехнологии. – 2006. – Режим доступа: http://biotechnolog.ru/ – Дата доступа: 20.06.2014.

6. Культуры клеток и Биореакторы (часть 1) [Электронный ресурс] – 2003. – Режим доступа: http://www.fermenter.ru/content/page_175_0.html? fermenterru=51c15959eac2bef4501e16a004cdeb47 – Дата доступа: 28.06.2014.

7. Сливко, И.А. Чувствительность перевиваемых линий клеток к вирусу бешенства, шт. 71-БелНИИЭВ-ВГНКИ / И.А. Сливко, Т.Ф. Горшкова, Е.М. Хрипунов, В.В. Недосеков, В.И. Жестерев, Н.А. Ковалев, М.М. Усеня // Сборник статей ВНИИВВиМ. – Покров, 2000. – С. 196–199.