Давиденко І.С., Давиденко О.М.

ПРИНЦИПИ СТАНДАРТИЗАЦІЇ ГІСТОХІМІЧНОЇ МЕТОДИКИ, ПРИДАТНОЇ ДЛЯ КІЛЬКІСНОЇ ОЦІНКИ, НА ПРИКЛАДІ МЕТОДИКИ НА ОКИСНЮВАЛЬНУ МОДИФІКАЦІЮ БІЛКІВ (ЛЕКЦІЯ)

Буковинський державний медичний університет, м. Чернівці, Україна

Вступ

Гістохімічна методика на окиснювальну модифікацію білків включає в себе чотири етапи: 1) власне гістохімічний етап (фарбування бромфеноловим синім за Мікель-Кальво); 2) оптичний етап (застосування мікроскопічної оптики); 3) фотографічний етап (застосування цифрового фотодокументування); 4) комп’ютерний мікроспектрофотометричний етап (аналіз кольору на цифрових мікрофотографіях). Це повідомлення стосується аналізу останніх трьох етапів. Перший етап описаний раніше.

З ілюстративною метою наводимо мікрофотовідбиток гістологічного зрізу кіркової речовини нирки лабораторного щура.

Рис. Кіркова речовина нирки лабораторного щура. Забарвлення гістологічного зрізу бромфеноловим синім за методом Мікель-Кальво (Mikel Calvo). Об.40х. Ок.10х.

Оптичний етап. На цьому етапі з усієї збільшувальної чи корегувальної оптики мікроскопа слід обмежитися використанням тільки його об’єктива. Окуляр та інші оптичні посередники між об’єктивом мікроскопа та фотокамерою слід виключити, оскільки кожен із них може дати свою хроматичну аберацію або інакшим чином впливає на світловий потік. Об’єктив мікроскопа повинен бути ахроматичним або ще краще – планахроматичним. Якщо використовується ахроматичний об'єктив, наступні вимірювання слід проводити тільки в центральних частинах зображення, щоби уникнути геометричних похибок. Освітлення в мікроскопі повинно бути достатньо яскравим, але не занадто, оскільки як недостатнє, так і надмірне освітлення може викликати викривлення кольору об’єктів. Тип освітлення не має принципового значення, бо цей стандарт відрегулюється на етапі фотографування шляхом виставлення певних параметрів цифрової фотокамери.

Фотографічний етап. На цьому етапі слід використати дзеркальну цифрову фотокамеру (без об’єктива), або цифрову фотокамеру недзеркального типу (з об’єктивом). В останньому випадку слід ретельно підійти до вибору фотокамери - об’єктив повинен бути з мінімальними хроматичними та просторовими абераціями. Нами успішно апробовані камери: Nikon D90, Olympus C740UZ, Olympus SP550UZ, Olympus SP820UZ, Konika Minolta DIMAGE Z3, Canon SX30IS. Відмінності в результативному показнику спостерігалися лише у 7-12-му знаках після коми. Найкраще цифрові фотознімки робити у форматі запису файлу (даних) RAW, оскільки цей формат є прямими показниками матриці фотокамери. Також, придатними можуть бути формати TIFF або JPG без стиснення. Принципово важливим є виставлення параметрів режиму «освітлення» у фотокамері. Не можна виставляти так званий «автоматичний режим», він не дасть стандартних результатів. Потрібно обрати один із неавтоматичних режимів.

Комп’ютерний мікроспектрофотометричний етап. Нами обрана система аналізу кольору RGB, оскільки вона дає стандартні результати в різних комп’ютерних програмах. Для прикладу зазначимо, що на даний час нами з рівним успіхом використовуються наступні безкоштовні комп’ютерні програми: ImageJ, GIMP (ліцензія GPL), Pixie, ColorPic, ColorPix. Найбільш розвиненими з названих є програми ImageJ, GIMP та ColorPic, оскільки вони дозволяють застосовувати не тільки попіксельний (точковий) аналіз, але й дають змогу використати зондовий метод (усереднені дані по групі пікселів). Наступним моментом стандартизації є проведення вимірювань у центральних частинах зображення, оскільки відомо, що найбільші сферичні та кольорові аберації відмічаються на периферії оптичного зображення. Це стосується навіть тих ситуацій, коли використовуються планахроматичні об’єктиви, оскільки їхня планахроматичність все ж не є абсолютною. І останнім, але найбільш важливим, моментом стандартизації аналізу кольору є використання відносних показників, а не абсолютних. Це дозволяє ефективно нівелювати всі можливі розбіжності у властивостях застосованої апаратури та устаткування. Зокрема, використання системи аналіз кольору RGB, передбачає можливість використання таких відносних показників як R/B та G/B. Власне ці показники і є мірою окиснювальної модифікації білків при дослідженні гістохімічних препаратів, пофарбованих бромфеноловим синім за методом Мікель-Кальво.

Висновок. Основними принципами стандартизації гістохімічних методик для кількісної оцінки є: застосовувати належні об'єктиви мікроскопа (найкраще це – планахроматичні), використовувати цифрові камери дзеркального типу або якщо недзеркальні, то з об'єктивом з мінімальними хроматичними та геометричними абераціями, не застосовувати автоматичні режими цифрових камер, запис цифрових даних у форматах графічних комп'ютерних файлів без втрати інформації (без стиснення), при аналізі графічного файлу використовувати комп'ютерні програми, які дозволяють застосовувати не тільки попіксельний (точковий) аналіз, але й дають змогу використати зондовий метод (усереднені дані по групі пікселів), для аналізу кольору використовувати систему аналізу кольору RGB, оскільки вона дає стандартні результати в різних комп’ютерних програмах.