Кухар
Е.В. к.в.н. доцент, Ермолаева А.Н.
Казахский
агротехнический университет им. С. Сейфуллина,
г.
Астана, Республика Казахстан
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГЕНОВ ASPERGILLUS FLAVUS – ВОЗБУДИТЕЛЯ МИКОЗОВ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА
Актуальность Грибы рода Aspergillus встречаются повсеместно,
включают в себя более 300 видов, однако, лишь немногие из них патогенны для
человека. Различные виды аспергиллов постоянно находятся в организме многих
здоровых животных и людей. Снижение резистентности организма, ухудшение условий
содержания и кормления способствует заболеванию аспергиллезом [1].
Аспергиллез – болезнь человека и животных, микоз, вызываемый
отдельными видами плесневых грибов рода Aspergillus
и проявляющая себя преимущественно вовлечением системы органов дыхания,
аллергической реакции, выходящего за рамки этой системы с развитием
диссеминации и специфическим поражением других органов. Основным методом
диагностики аспергиллеза является рентгенограмма легких или придаточных пазух,
компьютерная или магнитно-резонансная томография головного мозга, бронхоскопия,
получение бронхоальвеолярного лаважа или биопсия очагов поражения; микроскопия
материала и определение антигена
Aspergillus в сыворотки крови [2].
Выявление микогенной аллергии проводится кожными пробами с
аллергенами грибов и проведением тестов in vitro для определения специфического IgE. Кожные тесты считают более чувствительными,
чем тесты in vitro. Основными
методами определения общего и специфического IgE в практике
клиникодиагностических лабораторий являются радиоизотопный, хемилюминесцентный
и иммуноферментный. В связи с безвредностью для персонала, высокой
чувствительностью и специфичностью, простотой и доступностью наибольшее
распространение получил метод иммуноферментного анализа [3].
Налаженный ранее (до начала 90-х годов текущего столетия)
производственный выпуск отдельных грибковых аллергенов в России, к сожалению,
прекратился. Некоторые виды грибковых антигенов изготовляются в Европе. Они
представляют собой преимущественно экстракты из клеток грибов или фильтраты
культуральных жидкостей. Различают нативные нерастворимые и растворимые
фракционированные аллергены. Известны стандартные аллергены: бластомицины,
гистоплазмин, кандидин, аллергены из плесневых грибов (аспергиллов,
пенициллов). Антигены получают из зрелых, но не старых культур микроорганизмов.
Для получения полноценных антигенов применяют стандартные питательные среды и
оптимальные условия культивирования. Антигены в виде фильтратов или цельных
клеток являются наиболее полноценными. Они позволяют выявлять антитела в
сыворотке больных при различных клинических формах и на разных стадиях
заболевания, т.к.практически содержат наиболее полный набор антигенных
компонентов [4],
Целью работы
является получение антигенов Aspergillus flavus и их
иммунохимическая характеристика.
Материалы и
методы:
Материалом для работы
послужили: штамм Aspergillus
flavus, любезно
предоставленный к.в.н. Балджи Ю.А.; растворимый и корпускулярный антигены, полученные нами из биомассы гриба Aspergillus flavus;
вакцинный препарат ЛТФ-130 производства ФГУП
«Ставропольская биофабрика», использованный в качестве контроля.
Поверхностное культивирование плесневого гриба Asp. flavus проводили при температуре 37° С в течение 5 суток до
завершения формирования характерных колоний в чашках Петри и пробирках на
скошенном агаре. Глубинное культивирование микромицета проводили в колбах
объемом 250 мл, в которые вносили по 100 мл бульона Сабуро, антибиотики
пенициллин и стрептомицин для подавления роста бактериальной микрофлоры. Посевной
материал, взятый с поверхности чашек Петри, инокулировали по 0,1 мл. Штамм Asp. flavus выращивался на
универсальных качалках с амплитудой колебания 200 имп./мин. в течение 10 суток
при температуре 28˚С.
Выделение растворимых
белков клеточной стенки грибов проводили по методу L. Tabatabai (1975) [5]. Концентрацию углеводов в антигене определяли по
Молишу, концентрацию белка – по Бредфорду. Очистку антигенов от
низкомолекулярных соединений проводили методом диализа против дистиллированной
воды.
Корпускулярный антиген получали методом смыва дистиллированной водой спор с культуры Aspergillus flavus.
Взвесь спор кипятили в водяной бане 3 часа при 37° С. Полученную взвесь
использовали в качестве антигена.
Анализ антигенов проводили электрофорезом в полиакриламидном
геле в присутствии додецилсульфата натрия по методу J. Laemmli et al. [6]. Белковые полосы выявляли с помощью окраски электрофореграмм
реактивом Кумасси С-250, а полисахаридные – реактивом Шиффа.
Растворимые антигены анализировали в непрямом
варианте ИФА по общепринятой методике и реакции микроагглютинации [7].
Результаты
исследований
Глубинное культивирование гриба Aspergillus flavus проводили в течение 14 дней. В течение всего процесса
культивирования вели контроль роста микромицета. По результатам наблюдения
установлено, что прирост биомассы гриба наблюдается в течение всего периода
культивирования. В первый день рост колоний наблюдался в виде легкой
опалесценции. На второй день диаметр колоний составил 2,0 мм. В третий день
рост колоний достигал 5,0 мм.
Биомассу
гриба отделяли от жидкой питательной среды фильтрованием через бумажный фильтр,
сырой мицелий трижды промывали физиологическим раствором с целью максимального
освобождения от культуральной жидкости. Биомассу гриба Aspergillus flavus
использовали для получения антигенов.
Получение поверхностного растворимого антигена проводили
экстракцией цитратным буфером с последующим неоднократным центрифугированием.
Корпускулярный антиген получали методом смыва дистиллированной
водой спор с культуры Asp. flavus и инактивировали в водяной бане.
Концентрация
белка у растворимого и корпускулярного антигена Asp. flavus составляет – 0,125 мг/мл, в ЛТФ-130 – 0,25
мг/мл. Концентрация углеводов, соответственно, – 0,5; 0,03
мг/мл и 2,0 мг/мл (таблица 1).
Таблица
1 – Характеристика антигенов
Aspergillus flavus
|
Концентрация в (мг/мл) |
Белковый антиген |
Корпускулярный антиген |
ЛТФ-130 |
|
Углеводы |
0,5 |
0,03 |
2,0 |
|
Белки |
0,125 |
0,125 |
0,250 |
|
Отношение углеводов к белкам |
4:1 |
0,2:1 |
8:1 |
Очистку полученных антигенов
проводили диализом в
дистиллированной воде в течение 24 часов при температуре 4°С (рисунок 1).
Рисунок 1 – Очистка антигена методом
диализа
В дальнейшей работе нами был
проведен электрофорез по методу V.K Laemmli. В качестве геля использовали 7% полиакриламидный гель
в присутствии ДСН. Продолжительность процесса электрофоретического
разделения составила 3
часа. Сила тока в течение 15 минут поддерживалась в
пределах 10 мА, затем увеличивалась до 20 мА.
Образцы антигенов разводили, буфером в соотношении 1:1, кипятили
на водяной бане, охлаждали и вносили в лунки для образцов. В качестве
калибровочных белков использовали: бычий сывороточный альбумин – 67 кДа, яичный
альбумин – 45 кДа, ангидраза – 30 кДа, химотрипсиноген – 24 кДа и цитохром – 13
кДа. По окончанию электрофоретического разделения гель
окрашивали в течение 1 часа и отмывали в нескольких сменах обесцвечивающего
раствора до полного исчезновения фоновой окраски. Белковые полосы выявляли с
помощью окраски электрофореграмм реактивом Кумасси С-250 (рисунок 2).
|
Корпус-кулярный антиген |
Антиген по L. Tabatabai |
- |
Маркеры |
кДа |
||
|
|
68 45 25 12,5 |
|
||||
Рисунок 2 – Результаты электрофореза
антигенов гриба Aspergillus flavus
Как
видно из рисунка 2, пробы корпускулярного и растворимого антигенов гриба рода Aspergillus flavus
имеют
по 2 фракции белка с молекулярной массы 68 и 45кДа. При этом антиген,
полученный методом L. Tabatabai (1975), содержит белки с молекулярной массой 45 кДа в
большом количестве.
Анализ иммуногенной активности антигенов в РМА и непрямом
варианте ИФА показали следующее (таблица 2).
Таблица 2 – Результаты исследования иммуногенности антигенов Asp. flavus
|
Серологическая реакция |
Растворимый антиген |
Корпускулярный
антиген |
Контроль (ЛТФ-130) |
|
РМА |
1:256±0,35 |
1:512±0,5 |
1:256±0,44 |
|
ИФА |
1:800±0,44 |
1:400±0,65 |
1:800±0,35 |
Как видно из
результатов, полученные антигены обладают достаточной иммуногенностью и
индуцируют синтез специфических антител. Причем наиболее выражены эти свойства
у растворимого антигена.
Таким образом, в
результате проведенных исследований в процессе
глубинного культивирования была получена биомасса гриба Aspergillus flavus. Из биомассы
гриба были выделены и очищены специфические антигены. Растворимый
антиген имел концентрацию белков – 0,125 мг/мл и углеводов – 0,5 мг/мл;
корпускулярный антиген, соответственно, белков – 0,125 мг/мл, углеводов – 0,03
мг/мл. При
проведении ПААГ-электрофореза были выявлены молекулярные массы компонентов
антигенов плесневого гриба Asp. flavus.
В исследуемых антигенах выявлено наличие двух
белковых фракций с молекулярной массой 68 и 45 кДа.
При
постановке реакции микроагглютинации были отмечены высокие агглютинирующие свойства
сыворотки у корпускулярного антигена Asp. flavus. В непрямом варианте ИФА
титр специфических антител у иммунизированных мышей составил от 1:400 до 1:800.
Использованная литература:
1. Harman E.M., Szwed T. Aspergillosis (2003) // http://www.emedicine.com/med/topik174.htm.
2. Аравийский Р.А., Климко
Н.Н., Васильева Н.В. Диагностика микозов. Изд.дом. СПБМАПО. – 2006. – С.8-15.
3. Козлова Я.И., Васильева
Н.В. Микогенная аллергия у жителей пораженных микромицетами // Проблемы мед
микологии.– 2008. – С.17-18.
4. Елинов Н.П.
Противовоспалительные, антисептические и химиотерапевтические средства. В кн.:
Блинов Н.П., Громова Э.Г. Современные лекарственные препараты. –
Санкт-Петербург, 2000. – С. 591-595.
5. Tabatabai L.B., Deyoe
B.L. Isolation and characterisation of toxic fractions
from Brucella abortus //Infect.
Immunity. – 1979. – Vol. 26, №3. – Р. 668-679.
6. Laemmli U.K. Cleavage of
structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage // Nature
(London) – 1970. –
V. 227, T. 4. – P. 680-685.
7.
Кухар Е.В.
Иммуноферментный анализ в серологической диагностике дерматомикозов животных и
индикации антигена в объектах внешней среды // Сб. научных трудов КазНИВИ.
Т.LIV. - Алматы, 2008. - С. 272-281.