К.т.н. Полянская И.С.
Вологодская молочнохозяйственная
академия ВГМХА
им. Н.В. Верещагина, Россия
Маркеры антибиотико- и фагоустойчивости
в селекции молочнокислых культур
В
селекции молочнокислых культур с улучшенными производственно-ценными и
пробиотическими свойствами без использования генной модификации микроорганизмов
(ГММО) используют методы отбора рекомбинантов (мутантов, трансконъюгантов,
экс-конъюгантов, клонов), возникающих в результате мутаций. Для отбора
производственно-ценных мутантов используют селективные среды с антибиотиками.
Таким образом, маркировка микроорганизма антибиотиками – классическое условие
получения естественных рекомбинантов с улучшенными производственно-ценными
свойствами.
Значительная
часть штаммов молочнокислых микроорганизмов, в том числе пробиотических
чувствительна к большинству антибиотиков. Данные литературы свидетельствуют о том, что, в большинстве
случаев, Lactobacіllі и Bіfіdobacterіa не являются резистентными к таким
антибиотикам, как амоксициллин, доксициклин, фторхинолоны и цефалоспорины
[1,125].
Полирезистентные пробиотические культуры могут
применяться одновременно с антибиотиками для профилактики возникновения
побочных явлений со стороны пищеварительного тракта, вызванных пероральными
антибиотиками, а также для уменьшения экономического ущерба, связанного с возможностью
использовать для производства ферментированных молочных продуктов, молоко,
содержащее следы антибиотиков. Для
получения штаммов с множественной устойчивостью изучалась естественная
перекрестная резистентность с последующим отбором клонов-мутантов, устойчивых к
комплексному воздействию антибиотиков. Другие исследователи индуцировали подобные
мутации, с последующим отбором, или, с помощью генной инженерии, размещали ген
антибиотикоустойчивости на плазмиде-векторе. Последний подход имеет сущетвенный недостаток,
заключающийся в том, что существует риск плазмидной передачи патогенам резистентности
к антибиотикам [1,126].
Считают, что возможность распространения генов
резистентности достаточно высока только в случае перенесения мобильного
генетического элемента (плазмиды или транспозона) в результате генной
модификации микроорганизма, и отсутствует, если ген резистентности спонтанно
образовался в результате хромосомной
мутации [1,127]. Гены антибиотикоустойчивости часто являются хромосомными
(конституциальными).
Вместе с тем пробиотические микроорганизмы
должны быть устойчивыми к действию антибиотиков, кислоты и желчи, чтобы достичь
предполагаемой зоны колонизации в кишечнике.
С целью изучения природной
антибиотикоустойчивости и возможности получения штаммов, устойчивых к действию
антибиотиков мы отбирали спонтанно образующиеся мутанты антибиотикоустойчивых
клонов лактококков, культивируя культуры в гидролизованных молочных средах,
содержащих в мкг/см3: 1÷100 Cm (хлоромфеникола), 10÷2500 Sm (стрептомицина), 0,5÷15 Ар (ампицилина),
1÷100 Тс (тетрациклина), 1÷1000 Кm (канамицина), 1÷30- Пn (пеницилина), 1÷20 Gm (гентамицина). Провели 12-20 пассажей с постепенным увеличением
содержания антибиотика. После каждой
инкубации в течение 48 час на плотной среде (посев истощающимся штрихом), или
12 час на жидкой, культуру переносили на среду, содержащую более высокую
концентрацию антибиотика, значение повышения содержания которого определялось
практическим путем индивидуального для каждой культуры и антибиотика. Удалось
выделить культуры лактококков, устойчивые к следующим предельным концентрациям в мкг/см3:100 Cm, 2500 Sm, 10 Ар, 70 Тс,
1000 Кm, 25 Пn, 16 Gm.
Параллельно, через 3-4 пассажа с антибиотиком проверяли сохранение
антибиотирезистентными мутантами лактосбраживающей способности культивированием
в 10%-ном восстановленном молоке и активность сквашивания, определяемую без
присутствия антибиотика через 8 часов инокуляции 5% культуры [1,129].
В селекции конъюгативной передачей мы
использовали маркеры антибиотикоустойчивости лактококков (до, в 100 мг/ см3) к Sm
-2000, Тс - 70 и Cm -
50.
В отличие от
генов антибиотикоустойчивости, гены фагоустойчивости, как правило, находятся на
плазмидах. Известно, что штаммы лактококков, содержащие наборы плазмид, включающие
обычно 4-7 кольцевых ковалентнозамкнутых молекул ДНК, часто содержат ген различного механизма
фагоустойчивости. Гены фагоустойчивости плазмид контролируют три механизма
фагозащиты бактериальной клетки, действующие на различных этапах литического
цикла: в начале фаговой (подавление адсорбции фага); при введении фаговой ДНК в
клетку (рестрикация-модификация чужеродной ДНК) и во время репликации фага
(абортивная инфекция).
Один из способов получения естественных
рекомбинантов с улучшенными производственно-ценными свойствами генетического материала от клетки-донора к клетке реципиента, успешно
применяемый для молочнокислых микроорганизмов (лактококков и лактобцаилл) –
коньюгация - осуществляется при непосредственном контакте клеток между собой.
Способность быть донором определяется присутствием в бактериальной клетке
коньюгативной плазмиды. Неспособные к коньюгативному переносу плазмиды относят
к неконьюгативным.
В составе генома коньюгативной плазмиды,
молекулярная масса которой обычно превышает 25 МДа, имеется tra-оперон, гены которого осуществляют следующие основные функции:
1) Коньюгативный перенос собственной
плазмиды или хромосомной ДНК, начинающийся с определенного сайта (точки
интеграции плазмиды ori Т);
2)
Вегетативная репликация автономной плазмиды;
3)
Контроль числа копий плазмиды на хромосому и контроль несовместимости
родственных плазмид.
Неконьюгативные плазмиды не содержат
детерминантов, придающих бактериальной клетке свойство генетического донора.
Однако такие плазмиды могут быть перенесены в реципиентные клетки с помощью
конюгативных плазмид. Перенос коньюгативными плазмидами неконьюгативных
называется мобилизацией. При этом неконьюгативная плазмида является
мобилизуемой, а коньюгативная - мобилизующей.
Важную роль в генетике молочнокислых и
других грамположителъных бактерий сыграла мобилизующая конъюгативная
бирепликонная плазмида с широким кругом хозяев рАМв I (26.5 т.п.н.),
определяющая устойчивость к антибиотикам MLS-группы
(эритромицину, линкомицину и др.) способная мобилизовать на перенос
неконьюгативные плазмиды и бактериальную хромосому с частотой 10-4 –
10-8 .
Некоторые коньюгативные плазмиды
обеспечивают коньюгативный перенос ДНК при выращивании штаммов донора и
реципиента в жидкой среде, другие плазмиды более эффективно переносят
детерминанты при скрещивании на агаризованной среде в чашках Петри или при
контакте клеток на мембранных фильтрах, лежащих на питательном агаре.
Многочисленные исследования показали, что
частота трансмиссии плазмид зависит от времени контакта донора и реципиента, от
фазы их роста и наиболее эффективна, если донор и реципиент находятся в
логарифмической фазе роста. Существует большая зависимость эффективности
передачи маркеров от используемого реципиента.
Применение коньюгации при конструировании
промышленных штаммов микроорганизмов позволяет получать генетические
рекомбинанты с нужными свойствами без ГММО, однако широкие коньюгативные
возможности бирепликонных плазмид, подобных рАМв I, могут полезны только
для научных исследований, т.к. позволяют вводить плазмиды в клетки из различных промежуточных генетически
хорошо изученных реципиентных штаммов, например, хорошо трансформируемых Е. coli.
При изучении нами возможности передачи
плазмид в лактотокках, использовались два варианта (табл. 1.):
- конъюгативная двурепликонная плазмида pSB20mob способная реплицироолваться в грамм-отрицательных и грамм-положительных
бактериях;
- пары плазмид, одна из которых – конъюгативная плазмида Rp4, способная поддерживаться только в грамм-отрицательных микроорганизмах,
например Е. сoli, а вторая неконъюгативная плазмида pLFRI (pLFYM2), способная реплицироваться в грамм-отрицательных и грамм-положительных
бактериях и мобилизоваться с помощью Тра-генов Rp4 .
Таблица 1.– Конъюгационный перенос (мобилизаия) из Е. сoli в
лактококки.
|
Донорный
штамм Е. сoli/маркер |
Реципиентный
штамм/маркер |
Трансконъюгант |
|
S171 (pSB20mob)/Erm,
100 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis 17/Sm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis 17(pSB20mob) |
|
С600 (Rp4, pLFYM2)/Cm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis 17/Sm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis 17(pLFYM2) |
|
S171 (pSB20mob)/Erm,
100 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. сremoris 613/Пmr, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. сremoris 613 (pSB20mob) |
|
HB101(Rp4, pLFRI)/Cm,
10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6/Sm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6 (pLFRI) |
|
С600 (Rp4, pLFYM2)/Cm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6/Sm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6(pLFYM2) |
|
HB101(Rp4, pLFRI)/Cm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis 195/Sm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis 195(pLFRI) |
|
С600 (Rp4, pLFYM2)/Cm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis 195/Sm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. lactis 195(pLFYM2) |
|
С600 (Rp4, pLFYM2)/Cm, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. сremoris 613/Пmr, 10 мг/см3 |
Lactococcus lactis sp. сremoris 613(pLFYM2) |
Среди реципиентных штаммов были штаммы лактококков, содержащие несколько плазмид разного молекулярного размера, обладающих производственно важными свойствами для использования их в качестве заквасочных:
Lactococcus lactis sp. сremoris 613/Пmr, 10 мг/см3, Lactococcus lactis sp. lactis 195/Sm, 10 мг/см3, Lactococcus lactis sp. сremoris 613/Пmr, 10 мг/см3, а также бесплазмидный контрольный штамм Lactococcus lactis sp. lactis Lp1 T6/Sm, 10 мг/см3. Частота
переноса плазмид pSB20mob, pLFYM2 составила от 10-7 до 10-6 на одну донорную клекту.
При проверке у рекомбининтов способности сбраживать лактозу, определяемую по
способности свёртывать молоко, все трансконъюганты
подтвердили сохранение этого свойства после введения чужеродной бирепликонной
плазмиды. Однако, в ряде случаев, снизились и активность кислотообразования (по
продолжительности свертывания молока, инокулируемого 5% культуры) с 8 до 12
час, и энергия кислотообразования (по приросту титруемой кислотности) [1,129].
Таким образом, по результатам рекомбинаций
конъюгативной передачей (как наших, так и других иследователей) бирепликонных
плазмид получаются жизнеспособные трансконъюганты, но большиство из них
приобретают ухудшение некоторых производственных свойств.
Предпринята попытка использовать в качестве маркера
одной из родительских культур антибиотикоусточивость, а другой –
фагоспецифичность. Полученный конъюгативной передачей штамм с двойной
антибиотикоустойчивостью Lactococcus lactis sp. lactis 722/3/ Cm, 50, Sm, 2000 и культура Lactococcus lactis sp. diacetyllactis 613/6 скрещены и
отобран рекомбининтный клон на селективной среде, содержащий оба антибиотика и
литическую смесь фагов, вирулентную по отношению к штамму Lactococcus lactis sp. lactis 722/3/ Cm, 50, Sm, 2000, в то же время негомологичную по отношению к Lactococcus lactis sp. diacetyllactis 613/6. Фаготипирование рекомбинантного клона выявило его устойчивость к
ряду фагов литических по отношению к Lactococcus lactis sp. lactis 722/3/ Cm, 50, Sm, 2000 [1,137].
Таким образом, показана принципиальная возможность
использования маркеров антибиотикоустойчивости и фагоспецифичности и их
комбинации для отбора трансконъюгантов производствено-ценных штаммов, т.к.
признаки антибиотикоустойчивости и фагорезистенсности, в большинстве случаев
(около 90%), не являются сцепленными. В дальнейших исследованиях классические маркеры антибиотикоустойчивости, как
снижающие в проведенных испытаниях кислотообразующую активность, заменены на
маркеры фагоспецифичности.
Таким
образом:
1)
При селекции требуется контроль за культурами стартеров молочнокислых бактерий,
используемых для производства продуктов питания, в плане отсутствия мобильных
генетических элементов, которые включают гены антибиотикорезистентности.
2)
Работами многочисленных, в т.ч. наших исследований в области конъюгационного
переноса показана возможность практического применения конъюгации для селекции
штаммов молочнокислых микроорганизмов (лактококков и лактобацилл) с повышенной
фагоустойчивостью и антибиотической активностью, обладающих, по сравнению с
естественной селекцией, большей эффективностью.
3) В отличие от естественной,
индуцированной селекций и конъюгации между близкородственными видами микроорганизмов, использование в
генетических рекомбинациях мобилизующих конъюгативных бирепликонных плазмид с
широким кругом хозяев, полезно
с точки зрения молекулярно-генетического исследования стартеров, но,
ограничивает широкое практическое применение полученных рекомбинантов в составе
продуктов по причине возможности
дальнейшей передачи гена резистентности
антибиотику к микроорганизмам, патогенным для человека.
Литература:
1. Полянская И.С., Тераевич
А.С., Топал О.И., Новокшанова А.Л., Забегалова Г.Н. Нутрициологические, микробиологические,
генетические и биохимические основы разработки и производства продуктов с
пробиотиками. – Вологда-Молочное: ИЦ ВГМХА, 2013. – 200 с.
2. Gevers D., Huys G., Swings J.
In vitro conjugal transfer tetracycline resistance from Lactobacillus isolates
to other Gram-positive bacteria - FEMS Microbiol. Lett. — 2003. — Vol. 225, № 1. — P. 125-130.