ДНК-полимераза из T. thermophilus HB8

Карабаева А.А.

Таразский Государственный университет имени М.Х.Дулати

Жанатилеу Б., Жиентай А. - студенты 3 курса Био-211-5

Tth-ДНК-полимераза является ДНК-зависимой ДНК-полимеразой, состоит из одного полипептида молекулярной массы 94 кДа. Длина полипептидной цепи 834 аминокислотных остатка. Полимераза обладает 5^/-3^/-экзонуклеазной активностью и не имеет 3^/-5^/-экзонуклеазной (корректирующей) активности [4].

Оптимум рН для ПЦР с Tth-полимеразой находится в пределах от 8,5 до 9,0 [5]. Присутствие 0,01%-ного Твина-20 значительно повышает эффективность ПЦР c участием этой полимеразы, а добавление 0,01%-ного желатина ингибирует ее. Оптимальная концентрация каждого из пары праймеров для данной системы составляет 0,3 мМ. Показана возможность амплифицировать фрагменты ДНК длиной от 500 до 8500 п. н [5].

Одно из замечательных свойств Tth-полимеразы - способность фермента осуществлять синтез ДНК по цепи РНК в качестве матрицы. То есть было обнаружено, что данная полимераза обладает обратно-транскриптазной (ревертазной) активностью. Этот факт послужил стимулом для использования этого фермента в совмещенной реакции обратной транскрипции и ПЦР (ОТ/ПЦР).

Раньше часто проблематично было синтезировать к-ДНК используя мезофильные вирусные обратные транскриптазы из-за встречающихся в РНК стабильных вторичных структур. Различные методы описывают способы дестабилизации комплементарных районов: использование ДМСО, повышение температуры реакции и некоторые другие. Но добавление в реакционную смесь таких соединений и повышение температуры плохо сказывались на мезофильных ферментах.

Многие проблемы, связанные с большим содержанием вторичной структуры, присутствующей в РНК, минимизировались с использованием термостабильной ДНК полимеразы для обратной транскрипции. Стало возможным получать полноразмерные фрагменты ДНК и сразу амплифицировать их с использованием того же фермента. До Tth-полимеразы для этих целей применяли Taq-полимеразу. Но позже выяснили, что Tth-полимераза в 100 раз более активна в сопряженной реакции ОT/ПЦР [4, 1]. Чувствительность реакции, выполненной с использованием Tth-полимеразы позволяет детектировать (обнаруживать) продукт, полученный со 100 копий синтетической к-РНК [4]. В других работах удалось выявить этим же методом 10³ копий РНК интерлейкина 2б (IL-2б) [1] и получить исходя из 400пг суммарной РНК кДНК для мРНКинтерлейкина 1б. Причем слабый сигнал на агарозном гель-электрофорезе наблюдали уже при введении в реакцию 80 пг суммарной мРНК, что эквивалентно 10 клеткам [2].

Эффективность ревертазной стадии ОТ/ПЦР в присутствии различных двухвалентных катионов убывает в ряду: Mn²⁺ > Cu²⁺ > Mg²⁺ > Cd²⁺ >> Co²⁺. Показано, что использование Mn²⁺ вместо Mg²⁺ на стадии ПЦР приводит к снижению эффективности ОТ/ПЦР. В связи с этим авторы статьи после реакции обратной транскрипции (в присутствии 1 мМ MnCl₂) связывали ионы Mn²⁺ EGTA (так как EGTA имеет более низкое сродство к Mg²⁺, чем к Mn²⁺ и другим двухвалентным катионам) и далее проводили ПЦР в присутствии 1,5 мМ Mg²⁺ [1].

Процесс ОT/ПЦР оказался бесценным для выявления экспрессии генов, для амплификации последовательности РНК, последующего субклонирования и анализа, для диагностики инфекционных агентов или генетических заболеваний [4].

Очень интересна работа Игнатова К.Б с соавторами по рассмотрению различий в свойствах Taq- и Tth-полимераз и их возможная связь с аминокислотной последовательностью субдомена "большой палец" [3].Ранее был проведен сравнительный анализ консервативных областей полимеразного домена различных ДНК-полимераз и показано, что консервативный участок субдомена "большой палец" определяет способность ДНК-полимераз связываться с дуплексом матрица-праймер и влияет на процессивность фермента. Авторы сопоставили аминокислотные последовательности "большого пальца" и прилегающего к нему участка этих полимераз и Tth-полимеразы . Был заменен фрагмент Pvu I -BamH I гена Tth-полимеразы, кодирующий 492-595 аминокислотные остатки на соответствующий участок гена ДНК-полимеразы I E. coli, кодирующий 103 аминокислоты (586-688). Удалось получить экспресиию гибридного гена, продукт которого, названный Teco-полимеразой, был активен. В другом случае был заменен фрагмент Pvu I-BamH I гена Tth-полимеразы аналогичным фрагментом гена Taq-полимеразы, что привело к замене всех восьми неидентичных аминокислотных остатков в консервативной области "большого пальца". Новый фермент назвали Ttaq-полимеразой.

Ферментативные активности сравнивались при 72^o С для Tth- и Taq-полимераз и при 52^o C для Tth- и Teco-полимераз. Было обнаружено, что внесенные мутации не вызвали существенного изменения их удельной активности. Температурный оптимум Tth-, Taq- и Ttaq-полимераз находится в области 70-72^o С, а Teco-полимеразы- в области 50-52^o С. T_опт Teco-полимеразы на 15^o С выше и на 20^o С ниже Т_опт ДНК-полимеразы I E. coli и Tth-полимеразы соответственно. Более высокую, по сравнению с ДНК-полимеразой I E. coli, температуру функционирования Teco-полимеразы авторы объясняют влиянием термостабильных участков. Teco-полимераза является примером возможности создания функционально активных гибридов термостабильной и мезофильной ДНК-полимераз.

В работе показано, что оптимальной концентрацией Mg²⁺ для Taq-полимеразы является 2 мМ, а для Tth-, Ttaq- и Teco-полимеразы- 5 мМ. Далее была исследована способность полимераз амплифицировать фрагменты ДНК разной длины. ПЦР проводили при 1,5 мМ MgCl₂. При амплификации относительно короткого фрагмента ДНК более эффективной оказалась Taq-полимераза, но при амплификации более протяженных участков (больше 5000 п. о.) выход продукта на единицу активности фермента в случае Tth-полимеразы был значительно выше, чем при использовании Taq- и Ttaq-полимераз. Наличие некомплементарного нуклеотида на 3^/-конце синтезируемой цепи не влияет на эффективность синтеза ДНК Ttaq-полимеразой. Это свидетельствует о том, что Ttaq- так же, как и Tth-полимераза нечувствительна к наличию 3^/-некомплементарного нуклеотида [3].

Использованная литература

1) Гребенникова Т.В., Глухов А.И., Чистякова Л.Г., Киселев В.И., Северин Е.С. //Использование термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus КТП в совмещенной реакции обратной транскрипции и амплификации для детекции РНК интерлейкина 2б и определение экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости (MDR-1). - Молекулярная биология, 1995, том 29, вып. 4, с. 930-941.

2) Смирнов Ю.В., Чахмахчева О.Г., Ефимов В.А. // Рекомбинантная His6-ДНК-полимераза Thermus thermophilus с активностью обратной транскриптазы.- Биоорганическая химия, 1997, том 23, N 4, с. 257-261.

3) Игнатов К.Б, Крамаров В.М., Чистякова Л.Г., Мирошников А.И.// Факторы, определяющие различную процессивность ДНК-полимераз Thermus thermophilus и Thermus aquaticus при амплификации ДНК фага л. - Молекулярная биология, 1997, том 31, N 6, с. 956-961.

4) Myers, T.W., Gelfand D.H. // Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. - Biochemistry, 1991, v. 30, No. 31, p. 7661.

5) Глухов А.И., Трофимова М.Е., Гордеев С.А., Гребенникова Т.В., Виноградов С.В., Киселев В.И., Крамаров В.М. // Амплификация последовательностей ДНК фага л методом полимеразной цепной реакции с использованием термостабильной ДНК-полимеразы. - Молекулярная биология, 1991, том 25, вып. 6, с.1602-1609.