Состояние NO – синтазной окислительной системы под воздействием малых доз
олигоэфиров у крыс
Багмут
И.Ю., Жуков В.И., Клименко Н.А.
Харьковская медицинская академия последипломного
образования, Харьков, Украина
Харьковский национальный медицинский
университет, Харьков, Украина
Известно,
что активация свободнорадикальных процессов сопряжена метаболически с
образованием оксида азота (NO), который играет универсальную роль модулятора многих
физиологических функций сердечно-сосудистой, центральной нервной, иммунной,
мышечной, дыхательной, пищеварительной и других систем организма.NO
отвечает за тонус сосудов, межклеточную коммуникацию, модуляцию
нейротрансмиссии, уровень иммуннойцитотоксичности, секрецию гормонов,
медиаторов [1–3]. Вместе с тем, NOявляется потенциально
токсической молекулой, которая широко представлена при гипертензии, сахарном
диабете, новообразованиях, нейродегенеративных процессах, атеросклерозе,
циррозе печени, заболеваниях почек и других патологических явлениях [3–6]. Эта
молекула может быть губительной как для клеток, включая раковые, так и для
внутриклеточных патогенных микроорганизмов. Установлено, что цитотоксичностьNO
является результатом образования большого количества этих молекул, которые
инициируют апоптоз [1,2,4]. Двойственность действия NO проявляется в
способности защищать клетки от апоптозных сигналов и вызывать апоптоз. Будет
лимолекула NO обладать цитотоксическими свойствами, зависит от типа
клетки, фазы ее развития, биоэлектрического потенциала, локальной концентрации NO и
других активных форм кислорода (АФК). Свободный радикал NO в
клетках быстро взаимодействует с молекулярным кислородом,
супероксидныманион-радикалом кислорода и металлами гемовых и негемовых белков.
Вследствие этого в клетке образуются нитрозильные комплексы гемового и
негемового железа. Непосредственно с SH-группами белков
взаимодействует NO+, который образуетсяиз NOпосле
восстановления или взаимодействия с металлами. В результате этого в клетках,
при достаточном количестве тиолов, под влиянием NO осуществляется
нитрозилирование и изменение активности металлосодержащих белков и белков,
которые имеют активные цистеиновые центры [3–5]. Регуляция активности белков
нитрозилированием – один из способов контроля функции белков в клетке. При
образовании большого количества NO, он под влиянием NO-синтазы
может взаимодействовать с супероксидным анионом, образуя другую активную форму
кислорода – пероксинитрит (ONОО-), который
способен вступать в реакцию восстановления с глутатионом и углекислым газом. В
этом случае образуется нитрозопероксикарбонат (ONО2СО2-),
который легко вызывает химическую модификацию реактивных остатков тирозина в
белках, что сопровождается изменением их активности. Кроме того, токсический
пероксинитрит способен неэнзиматически продуцировать гидроксильные токсические
радикалы (ОН-), включая таким образом молекулы NO в
процесс образования новых АФК [4,5]. Последние (ОН·,NO·, ONОО·)
обладают свойствами окислять белки и липиды, нарушать структуру биологических
мембран. Повышение количества АФК в клетке может трансформировать эффекты NOиз
защитных в цитотоксические.
Олигоэфиры
– объекты настоящего исследования – представляют собой новый ранее неизученный
класс олигоэфиров. Они нашлиширокое применение в различных отраслях народного
хозяйства: дляполучения пластмасс, пенопластов, полиуретанов, эмалей, лаков,
гидравлических и тормозных жидкостей, эпоксидных смол и др.
Учитывая
вышесказанное, при изучении механизмов действия этих олигоэфиров на организм
значительный интерес представляет исследование состоянияNO-синтазнойокислительной
системы при длительном воздействии малых доз олигоэфиров. Эти данные могут
также иметь значение для прогностической оценки потенциальной опасности олигоэфиров
для человека и окружающей среды, которая в настоящее время отсутствует.
Материалы и методы
исследования. Опыты
проведенына 80 половозрелых крысах популяции Вистар массой 180-200 г. Животные
были распределены на опытные (9) и контрольную группы по 8 крыс в
каждой.Опытным животным ежедневно в течение 45 дней утром натощак с помощью
металлического зонда перорально вводили водные растворы олигоэфиров в различных
малых дозах: 1/10, 1/100, 1/1000 ЛД50. Контрольная группа получала
аналогичные объемы питьевой воды. Опыты ставили с соблюдением Закона Украины «О
защите животных от жестокогообращения» от 21.02.06 № 3477 – 1У.
Изучали
влияниеолигоэфировмарок: Л-501-2-100 (ацетали монометилового эфира
полиоксиэтиленгликоля); Л-1601-2-50 «Б» (бутилаллиловый эфир полиокспропиленоксиэтиленгликоля)
и Л-1601-2-50 «Р» (ацеталимонобутилового эфира
полиокспропиленоксиэтиленгликоля) с регламентированными физико-химическими
свойствами. На основании параметров острой токсичности данные соединения
относятся к умеренно и малотоксичным веществам, необладающим кумулятивными
свойствами. Среднесмертельные дозы (ЛД50) были установлены на
уровнях:3,4; 3,85 и 5,17 г/кг массы животного, а коэффициенты кумуляции– 9,8;
9,17 и 7,13.
Состояние
окислительной NO-синтазной системы изучали в соответствии с методическими
рекомендациями «Діагностика ендотеліальної функції –
оцінка вазоактивного пулу оксиду азоту»(МОЗ України, Київ, 2007,
20 с.).Определяли
содержание в сыворотке крови нитритов (NO2), нитратов (NO3), S-нитрозотиола,
активность эндотелиальной (эNOS) и индуцибельной (иNOS) NO-синтазы.
Статистическую
обработку полученных результатов проводили с использованием критерия
Стьюдента–Фишера.
Результаты исследования
и их обсуждение.Изучение
состояния NO-синтазной окислительной системы у крыс, подвергавшихся
воздействию олигоэфиров, обнаружило увеличение содержания в сыворотке крови
метаболитов обменаNO– нитритов, нитратов, S-нитрозотиолов–
и активности эNOS и иNOS при дозах 1/10 и 1/100
ЛД50. Действие 1/1000 ЛД50 не привело к изменению показателей
NO-синтазнойокислительной системы по сравнению с группой
контроля. Наиболее значимые динамические нарушения функции данной системы
наблюдались под влиянием 1/10 ЛД50 (табл. 1). СодержаниеNO2в сыворотке крови
повышалось на 110,2%, 91,3% и 124,4%соответственно при воздействии Л-501-2-100,
Л-1601-2-50 «Б» и Л-1601-2-50 «Р». Уровень NO3возрастал на 45,9%,
34,4% и 59,4%.Активность эNOSувеличивалась
на 64,9%, 38,6% и 59,6%, иNOS– на123,1; 111,5% и
138,5%. Ксенобиотики в дозах 1/100 ЛД50 оказывали менее значимое
влияние на уровни исследуемых показателей. Так, содержание нитритов
увеличивалось на84,2%, 62,9% и 93,7%, нитратов – на 34,04%, 17,4% и 42,5%, S-нитрозотиолов
– на28,1%, 18,7% и 43,7%.Активность эNOS повышалась на 50,8%,
28,1% и 47,4%, иNOS– на100%, 84,6% и 115,4%.
Высокие
уровни в сыворотке крови нитритов, нитратов и активность эNOS
и иNOSсвидетельствовали о повышении продукцииNO,
которое имело тесную связь с дозой воздействия олигоэфиров.
Таблица 1
Влияние олигоэфиров на
состояние NO-синтазной окислительной системы
Показатели
|
Доза ЛД50 |
Группа
наблюдения, вещества (М±m) |
|||
Л-501-2-100 |
Л-1601-2-50
«Б» |
Л-1601-2-50
«Р» |
Контроль
|
||
NO2(мкм/л) |
1/10 |
26,7±1,5* |
42,3±1,7* |
28,5±2,1* |
12,7±1,4 |
1/100 |
23,4±1,8* |
20,7±1,3* |
24,6±1,5* |
||
1/1000 |
10,6±1,3 |
11,8±1,1 |
12,2±1,6 |
||
NO3(мкм/л) |
1/10 |
34,3±2,2* |
31,5±1,6* |
37,2±2,3* |
23,5±1,6 |
1/100 |
31,5±2,4* |
27,6±2,1* |
33,5±2,7* |
||
1/1000 |
21,7±1,8 |
22,5±1,4 |
20,9±1,7 |
||
S-нитрозотиол (ммоль/л) |
1/10 |
0,47±0,04* |
0,43±0,05* |
0,51±0,04* |
0,32±0,03 |
1/100 |
0,41±0,05* |
0,38±0,03* |
0,46±0,05* |
||
1/1000 |
0,29±0,03 |
0,28±0,04 |
0,31±0,03 |
||
э NOS
(ммоль/мин·мг белка) |
1/10 |
0,94±0,06* |
0,79±0,05* |
0,91±0,07* |
0,57±0,08 |
1/100 |
0,86±0,07* |
0,73±0,06* |
0,84±0,08* |
||
1/1000 |
0,42±0,05 |
0,48±0,04 |
0,52±0,05 |
||
и NOS
(ммоль/мин·мг белка) |
1/10 |
0,58±0,05* |
0,55±0,06* |
0,62±0,05* |
0,26±0,04 |
1/100 |
0,52±0,04* |
0,48±0,03* |
0,56±0,04* |
||
1/1000 |
0,20±0,03 |
0,22±0,04 |
0,21±0,03 |
Примечание:
* различия достоверные р<0,05
Таким
образом, исследуемые олигоэфирывызывают активацию NO-синтазной окислительной
системы. При этом отмечается дозозависимость воздействия олигоэфиров: в
минимальной изучаемой дозе (1/1000 ЛД50) эффекта не наблюдается,
бóльшие дозы(1/100 и 1/10ЛД50) вызывают достоверный эффект; с
увеличением дозы активация системы усиливается.
Учитывая
механизмы действия иNOS и эNOS, следует полагать, что
данные ферменты катализируют образование существенного количества NO в
ответ на химическую стимуляцию олигоэфирами. Механизм действия этих изоформ
ферментов сходен и состоит в следующем: ионы Са2+ под влиянием
нейромедиаторных стимулов входят в клетку, где в цитозоле связываются в единый
комплекс с кальцийсвязывающим белком кальмодулином. Комплекс Са2+–кальмодулин
выступает как кофактор и активирует NOS и продукциюNO.
Последний, в свою очередь, активирует клеточный цитоплазматический фермент
гуанилатциклазу, что приводит к образованию циклического гуанозинмонофосфата
(цГМФ), который опосредует все эффекты NO через сложную систему
биохимических реакций, инициируя многочисленные биохимические процессы и
развитие защитных реакций или патологических явлений [2,3].
Существенное накопление NO в клетке приводит к его
быстрому взаимодействию с молекулярным кислородом,
супероксидныманион-радикалом, металлами гемсодержащих и негемовых белков и
продукции реакционоспособных АФК, свободных радикалов, перекисей,
гидроперекисей, обладающих мембраноповреждающим действием.
Выводы.Продолжительное введение
исследуемых олигоэфиров в дозах 1/10 и 1/100 ЛД50 приводит к
значительной активацииNO-синтазной окислительной
системы и, по-видимому, накоплению оксида азота, свободных радикалов,активных
форм кислорода,перекисей, гидроперекисей, обладающих мембранотропным действием
и формирующих развитие свободнорадикальных реакций. При этом доза 1/10 ЛД50вызывает
более выраженный эффект, чем 1/100. Вдозе 1/1000 ЛД50все испытуемые
вещества не оказывают влияния.
Литература:
1. Гуревич К.Г.,
Шимановский Н.Л. Оксид азота: биосинтез, механизмы действия, функция // Вопросы
биологии, медицины и фармацевт. химии. -
2000. - № 4. – С. 16-21.
2.
Зайцева
О.В., Жукова Н.В., Броше Е.А. Состояние активности NO-синтазы и содержание
оксида азота у больных псориазом // Вісн.проблем біології і медицини. – 2002. – №
1. – С. 80-85.
3. MoncadaS., HiggsA. Mechanismsofdisease: theL-arginine-nitricoxidepathway
//NewEngl. J. Med. – 1993. – Vol. 329. – P. 2002-2012.
4. ЖуковВ.І., Мясоедов В.В. NO-залежні
механізми токсичності синтетичних детергентів. ВІсн. проблем біології і
медицини 2002; 9-10: 12-21.
5.
Циганенко
А.Я., Жуков В.И., Щербань Н.Г., Евдокимов В.И., Пивень В.И. и др. Научные
основы обоснованияпрогнозапотенциальнойопасностидетергентов в связи с
регламентацией в водеводоемов. – Белгород, 2001. – 442 с.
6.
Щербань
Н.Г., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Капустник В.А. Биохимическиемеханизмырадиомиметическихэффектовповерхностно-активныхвеществ.
– Харьков: «РаритетыУкраины», 2012. – 118 с.