Состояние NO – синтазной окислительной системы под воздействием малых доз олигоэфиров у крыс

Багмут И.Ю., Жуков В.И., Клименко Н.А.

Харьковская медицинская академия последипломного образования, Харьков, Украина

Харьковский национальный медицинский университет, Харьков, Украина

Известно, что активация свободнорадикальных процессов сопряжена метаболически с образованием оксида азота (NO), который играет универсальную роль модулятора многих физиологических функций сердечно-сосудистой, центральной нервной, иммунной, мышечной, дыхательной, пищеварительной и других систем организма.NO отвечает за тонус сосудов, межклеточную коммуникацию, модуляцию нейротрансмиссии, уровень иммуннойцитотоксичности, секрецию гормонов, медиаторов [1–3]. Вместе с тем, NOявляется потенциально токсической молекулой, которая широко представлена при гипертензии, сахарном диабете, новообразованиях, нейродегенеративных процессах, атеросклерозе, циррозе печени, заболеваниях почек и других патологических явлениях [3–6]. Эта молекула может быть губительной как для клеток, включая раковые, так и для внутриклеточных патогенных микроорганизмов. Установлено, что цитотоксичностьNO является результатом образования большого количества этих молекул, которые инициируют апоптоз [1,2,4]. Двойственность действия NO проявляется в способности защищать клетки от апоптозных сигналов и вызывать апоптоз. Будет лимолекула NO обладать цитотоксическими свойствами, зависит от типа клетки, фазы ее развития, биоэлектрического потенциала, локальной концентрации NO и других активных форм кислорода (АФК). Свободный радикал NO в клетках быстро взаимодействует с молекулярным кислородом, супероксидныманион-радикалом кислорода и металлами гемовых и негемовых белков. Вследствие этого в клетке образуются нитрозильные комплексы гемового и негемового железа. Непосредственно с SH-группами белков взаимодействует NO⁺, который образуетсяиз NOпосле восстановления или взаимодействия с металлами. В результате этого в клетках, при достаточном количестве тиолов, под влиянием NO осуществляется нитрозилирование и изменение активности металлосодержащих белков и белков, которые имеют активные цистеиновые центры [3–5]. Регуляция активности белков нитрозилированием – один из способов контроля функции белков в клетке. При образовании большого количества NO, он под влиянием NO-синтазы может взаимодействовать с супероксидным анионом, образуя другую активную форму кислорода – пероксинитрит (ONОО^-), который способен вступать в реакцию восстановления с глутатионом и углекислым газом. В этом случае образуется нитрозопероксикарбонат (ONО₂СО₂^-), который легко вызывает химическую модификацию реактивных остатков тирозина в белках, что сопровождается изменением их активности. Кроме того, токсический пероксинитрит способен неэнзиматически продуцировать гидроксильные токсические радикалы (ОН^-), включая таким образом молекулы NO в процесс образования новых АФК [4,5]. Последние (ОН^·,NO^·, ONОО^·) обладают свойствами окислять белки и липиды, нарушать структуру биологических мембран. Повышение количества АФК в клетке может трансформировать эффекты NOиз защитных в цитотоксические.

Олигоэфиры – объекты настоящего исследования – представляют собой новый ранее неизученный класс олигоэфиров. Они нашлиширокое применение в различных отраслях народного хозяйства: дляполучения пластмасс, пенопластов, полиуретанов, эмалей, лаков, гидравлических и тормозных жидкостей, эпоксидных смол и др.

Учитывая вышесказанное, при изучении механизмов действия этих олигоэфиров на организм значительный интерес представляет исследование состоянияNO-синтазнойокислительной системы при длительном воздействии малых доз олигоэфиров. Эти данные могут также иметь значение для прогностической оценки потенциальной опасности олигоэфиров для человека и окружающей среды, которая в настоящее время отсутствует.

Материалы и методы исследования. Опыты проведенына 80 половозрелых крысах популяции Вистар массой 180-200 г. Животные были распределены на опытные (9) и контрольную группы по 8 крыс в каждой.Опытным животным ежедневно в течение 45 дней утром натощак с помощью металлического зонда перорально вводили водные растворы олигоэфиров в различных малых дозах: 1/10, 1/100, 1/1000 ЛД₅₀. Контрольная группа получала аналогичные объемы питьевой воды. Опыты ставили с соблюдением Закона Украины «О защите животных от жестокогообращения» от 21.02.06 № 3477 – 1У.

Изучали влияниеолигоэфировмарок: Л-501-2-100 (ацетали монометилового эфира полиоксиэтиленгликоля); Л-1601-2-50 «Б» (бутилаллиловый эфир полиокспропиленоксиэтиленгликоля) и Л-1601-2-50 «Р» (ацеталимонобутилового эфира полиокспропиленоксиэтиленгликоля) с регламентированными физико-химическими свойствами. На основании параметров острой токсичности данные соединения относятся к умеренно и малотоксичным веществам, необладающим кумулятивными свойствами. Среднесмертельные дозы (ЛД₅₀) были установлены на уровнях:3,4; 3,85 и 5,17 г/кг массы животного, а коэффициенты кумуляции– 9,8; 9,17 и 7,13.

Состояние окислительной NO-синтазной системы изучали в соответствии с методическими рекомендациями «Діагностика ендотеліальної функції – оцінка вазоактивного пулу оксиду азоту»(МОЗ України, Київ, 2007, 20 с.).Определяли содержание в сыворотке крови нитритов (NO₂), нитратов (NO₃), S-нитрозотиола, активность эндотелиальной (эNOS) и индуцибельной (иNOS) NO-синтазы.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стьюдента–Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение.Изучение состояния NO-синтазной окислительной системы у крыс, подвергавшихся воздействию олигоэфиров, обнаружило увеличение содержания в сыворотке крови метаболитов обменаNO– нитритов, нитратов, S-нитрозотиолов– и активности эNOS и иNOS при дозах 1/10 и 1/100 ЛД₅₀. Действие 1/1000 ЛД₅₀ не привело к изменению показателей NO-синтазнойокислительной системы по сравнению с группой контроля. Наиболее значимые динамические нарушения функции данной системы наблюдались под влиянием 1/10 ЛД₅₀ (табл. 1). СодержаниеNO₂в сыворотке крови повышалось на 110,2%, 91,3% и 124,4%соответственно при воздействии Л-501-2-100, Л-1601-2-50 «Б» и Л-1601-2-50 «Р». Уровень NO₃возрастал на 45,9%, 34,4% и 59,4%.Активность эNOSувеличивалась на 64,9%, 38,6% и 59,6%, иNOS– на123,1; 111,5% и 138,5%. Ксенобиотики в дозах 1/100 ЛД₅₀ оказывали менее значимое влияние на уровни исследуемых показателей. Так, содержание нитритов увеличивалось на84,2%, 62,9% и 93,7%, нитратов – на 34,04%, 17,4% и 42,5%, S-нитрозотиолов – на28,1%, 18,7% и 43,7%.Активность эNOS повышалась на 50,8%, 28,1% и 47,4%, иNOS– на100%, 84,6% и 115,4%.

Высокие уровни в сыворотке крови нитритов, нитратов и активность эNOS и иNOSсвидетельствовали о повышении продукцииNO, которое имело тесную связь с дозой воздействия олигоэфиров.

Таблица 1

Влияние олигоэфиров на состояние NO-синтазной окислительной системы

Показатели	Доза ЛД50	Группа наблюдения, вещества (М±m)
		Л-501-2-100	Л-1601-2-50 «Б»	Л-1601-2-50 «Р»	Контроль
NO2(мкм/л)	1/10	26,7±1,5*	42,3±1,7*	28,5±2,1*	12,7±1,4
	1/100	23,4±1,8*	20,7±1,3*	24,6±1,5*
	1/1000	10,6±1,3	11,8±1,1	12,2±1,6
NO3(мкм/л)	1/10	34,3±2,2*	31,5±1,6*	37,2±2,3*	23,5±1,6
	1/100	31,5±2,4*	27,6±2,1*	33,5±2,7*
	1/1000	21,7±1,8	22,5±1,4	20,9±1,7
S-нитрозотиол (ммоль/л)	1/10	0,47±0,04*	0,43±0,05*	0,51±0,04*	0,32±0,03
	1/100	0,41±0,05*	0,38±0,03*	0,46±0,05*
	1/1000	0,29±0,03	0,28±0,04	0,31±0,03
э NOS (ммоль/мин·мг белка)	1/10	0,94±0,06*	0,79±0,05*	0,91±0,07*	0,57±0,08
	1/100	0,86±0,07*	0,73±0,06*	0,84±0,08*
	1/1000	0,42±0,05	0,48±0,04	0,52±0,05
и NOS (ммоль/мин·мг белка)	1/10	0,58±0,05*	0,55±0,06*	0,62±0,05*	0,26±0,04
	1/100	0,52±0,04*	0,48±0,03*	0,56±0,04*
	1/1000	0,20±0,03	0,22±0,04	0,21±0,03

Примечание: * различия достоверные р<0,05

Таким образом, исследуемые олигоэфирывызывают активацию NO-синтазной окислительной системы. При этом отмечается дозозависимость воздействия олигоэфиров: в минимальной изучаемой дозе (1/1000 ЛД₅₀) эффекта не наблюдается, бóльшие дозы(1/100 и 1/10ЛД₅₀) вызывают достоверный эффект; с увеличением дозы активация системы усиливается.

Учитывая механизмы действия иNOS и эNOS, следует полагать, что данные ферменты катализируют образование существенного количества NO в ответ на химическую стимуляцию олигоэфирами. Механизм действия этих изоформ ферментов сходен и состоит в следующем: ионы Са²⁺ под влиянием нейромедиаторных стимулов входят в клетку, где в цитозоле связываются в единый комплекс с кальцийсвязывающим белком кальмодулином. Комплекс Са²⁺–кальмодулин выступает как кофактор и активирует NOS и продукциюNO. Последний, в свою очередь, активирует клеточный цитоплазматический фермент гуанилатциклазу, что приводит к образованию циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), который опосредует все эффекты NO через сложную систему биохимических реакций, инициируя многочисленные биохимические процессы и развитие защитных реакций или патологических явлений [2,3]. Существенное накопление NO в клетке приводит к его быстрому взаимодействию с молекулярным кислородом, супероксидныманион-радикалом, металлами гемсодержащих и негемовых белков и продукции реакционоспособных АФК, свободных радикалов, перекисей, гидроперекисей, обладающих мембраноповреждающим действием.

Выводы.Продолжительное введение исследуемых олигоэфиров в дозах 1/10 и 1/100 ЛД₅₀ приводит к значительной активацииNO-синтазной окислительной системы и, по-видимому, накоплению оксида азота, свободных радикалов,активных форм кислорода,перекисей, гидроперекисей, обладающих мембранотропным действием и формирующих развитие свободнорадикальных реакций. При этом доза 1/10 ЛД₅₀вызывает более выраженный эффект, чем 1/100. Вдозе 1/1000 ЛД₅₀все испытуемые вещества не оказывают влияния.

Литература:

1. Гуревич К.Г., Шимановский Н.Л. Оксид азота: биосинтез, механизмы действия, функция // Вопросы биологии, медицины и фармацевт. химии. - 2000. - № 4. – С. 16-21.

2. Зайцева О.В., Жукова Н.В., Броше Е.А. Состояние активности NO-синтазы и содержание оксида азота у больных псориазом // Вісн.проблем біології і медицини. – 2002. – № 1. – С. 80-85.

3. MoncadaS., HiggsA. Mechanismsofdisease: theL-arginine-nitricoxidepathway //NewEngl. J. Med. – 1993. – Vol. 329. – P. 2002-2012.

4. ЖуковВ.І., Мясоедов В.В. NO-залежні механізми токсичності синтетичних детергентів. ВІсн. проблем біології і медицини 2002; 9-10: 12-21.

5. Циганенко А.Я., Жуков В.И., Щербань Н.Г., Евдокимов В.И., Пивень В.И. и др. Научные основы обоснованияпрогнозапотенциальнойопасностидетергентов в связи с регламентацией в водеводоемов. – Белгород, 2001. – 442 с.

6. Щербань Н.Г., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Капустник В.А. Биохимическиемеханизмырадиомиметическихэффектовповерхностно-активныхвеществ. – Харьков: «РаритетыУкраины», 2012. – 118 с.