Состояние гидроксилирующей монооксигеназной системы гепатоцитов под влиянием разных доз олигоэфиров

Багмут И.Ю., Клименко Н.А., Жуков В.И.

Харьковская медицинская академия последипломного образования, Харьков, Украина

Харьковскийнациональныймедицинскийуниверситет, Харьков, Украина

Многочисленные работы по изучению метаболизма чужеродных для организма веществ показали, что он осуществляется в основном путем окисления в микросомальнойгидроксилирующеймонооксигеназной системе гепатоцитов [1,2].  Большое распространение имеют и синтетические реакции, а именно: связывание с белками, аминокислотами, глюкуроновой и серной кислотами [3]. В большинстве случаев ксенобиотики подвергаются в организме последовательным превращениям – модификации, а взавершение –    синтетическимреакциями конъюгации. Исследования показывают, что начальная фаза метаболизма может существенно отразитьсяна биологических свойствах химических соединений. Они могут быть усилены, ослаблены или модифицированы [1 – 3]. Изучение метаболизма  химических веществ не только представляет общебиологический интерес, но и дает важный прогностический материал для разработки мер специфической и неспецифической профилактики, направленной на сохранение и укрепление здоровья населения и рабочих, занятых в сфере химического производства, а также для диагностики интоксикаций и патогенетической терапии [4,5].

Основное значение в метаболизме чужеродных для организма веществпридается микросомальным ферментам, которые подвергают окислению разнообразные по строению органические неполярные соединения. Ведущим типом реакции обычно является гидроксилирование, которое в упрощенной форме представляется в следующем виде.Восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ·Н2) превращает кислород в активную молекулярную форму; активированный кислород в присутствии различных гидроксилазгидроксилирует чужеродное соединение, что является обычно первой фазой реакции, направленной на ускорение элиминации ксенобиотиков из организма. Основной структурно-функциональной единицей, осуществляющей эти процессы, является эндоплазматическая сеть гепатоцитов, а именно ферментная система  микросомальной мембраны.При изучении вредного воздействия на организм факторов окружающей и производственной среды для оценки резервных возможностей и степени устойчивости организма к неблагоприятному воздействию наиболее адекватными являются методы исследования модифицирующего действия химических загрязнителей на уровне микросомальнойоксидазной системы с параллельным исследованием возможного неблагоприятного эффекта на уровне мембраноструктурированных ферментов[2,4,5].

Олигоэфиры, чье влияние на организм исследуется в данной работе,  представляют собой новый ранее неизученный класс химических веществпромышленности органического синтеза с регламентированными физико-химическими свойствами. Онинашли широкое применение для получения пластмасс, пенопластов, полиуретанов, искусственной кожи, эпоксидных смол, лаков, эмалей и т.д., и имеют распространенное использование во многих отраслях народного хозяйства.

Учитывая вышесказанное, целью работы являлось изучение влияния олигоэфиров в малых дозах на микросомальнуюмонооксигеназную систему гепатоцитов и активностьмембраноструктурированных ферментов.

Материалы и методы исследования. Исследования проведены на половозрелых крысах популяции Вистар массой 180-200 г, которые напротяжении 45 сутокежедневно подвергались воздействию ксенобиотиками в дозах 1/10, 1/100 и 1/1000 ЛД50. Вещества в виде водных растворов вводили внутрижелудочно с помощью металлического зонда утром до кормления животных. Контрольная группа крыс получала соответствующие объемы питьевой воды. Опыты проводили с соблюдением международных принципов «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 1985) и «Общих этических принципов экспериментов на животных», одобренных I национальным конгрессом по биоэтике(Киев, 2001).

Исследовали влияние олигоэфиров таких марок: Л-501 -2-100 (ацетали монометилового эфира полиоксиэтиленгликоля), Л-1601-2-50 «Б» (бутилаллиловый эфир полиоксипропиленоксиэтиленогликоля), Л-1601-2-50 «Р» (ацеталимонобутилового эфира полиоксипропиленоксиэтиленогликоля). На основании параметров токсичностиэти вещества относят к умеренно- и малотоксичным соединениям, не обладающим кумулятивными свойствами. Их среднесмертельные дозы (ЛД50) были определены на уровнях: 3,46, 3,85 и 5,17 г/кг массы животного,а коэффициенты кумуляции (Кк)  - 9,8; 9,17 и 7,3,соответственно для Л-501 -2-100, Л-1601-2-50 «Б», Л-1601-2-50 «Р».

Определяли такие показатели микросомального окисления, как активность О-деметилазы, НАДФ·Н–цитохром С – редуктазы,НАД·Н–цитохром С – редуктазы, скорость эндогенного дыхания микросом, скорость окисления НАДФ·Н, скорость окисления НАДФ·Н в присутствии ЭДТА, скорость перекисного окисления липидов и содержание цитохромов Р450 и в5[1,2,5].В качестве субстрата микросомальной Р450-зависимой системы использовали Р-нитроанизол –ксенобиотик, который подвергается оксислительномудеметилированию с образованием Р-нитрофенола, обладающего характерным спектром поглощения в щелочной среде.

Полученные результаты обрабатывали методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента-Фишера.

Результаты исследования и обсуждение.Олигоэфиры в малых дозах заметно влияли наактивность двух электронно-транспортных цепей микросом (НАДФ·Н-связывающей системы с цитохромом  Р450 в качестве конечного звена и НАД·Н-системы, связанной с цитохромом в5 в качестве акцептора электронов). Активность О-деметилазы, НАДФ·Н–цитохром С – редуктазы и НАД·Н–цитохром С – редуктазыповышалась при воздействии всех исследуемых веществ в дозах1/10 и 1/100 ЛД50(табл. 1). В дозе 1/1000 ЛД50ксенобиотики не влияли на данные показатели.

Так,у животных, которые подвергались воздействию Л-501-2-100, под влиянием 1/10 и 1/100 ЛД50 активность деметилазы увеличиваласьсоответственно на 164,88% и 141,08%, НАДФ·Н–цитохромС –редуктазы – на 69,8% и 57,5%

Таблица 1

О-деметилазная (нмоль р-нитрофенола/мин· мг белка), НАД·Н– и  НАДФ·Н–цитохром С –редуктазная (нмольцитохрома С /мин·мг белка)активности микросом печени крыс

Вещества, доза ЛД50

Показатели, М±m

О-деметилаза

НАДФ·Н–

 цитохром С–редуктаза

НАД·Н–цитохром С –редуктаза

Л-501-2-100

1/10

17,8±1,43*

350,4±56,7*

1483,5±46,2*

1/100

16,20±1,35*

280,6±35,4*

1376,2±60,3*

1/1000

7,15±0,68

210,3±21,6

917,4±34,8

Л-1601-2050 «Б»

1/10

18,6±1,22*

363,2±65,8*

1397,3±41,5*

1/100

14,76±1,28*

264,5±27,3*

1283,7±57,2*

1/1000

6,84±0,73

205,4±18,7

853,6±42,4

Л-1601-2050 «Р»

1/10

16,53±1,47*

324,6±39,4*

1523,8±62,6*

1/100

13,46±1,15*

285,3±17,6*

1415,8±53,6*

1/1000

6,45±0,62

186,4±20,8

865,3±38,6

Контроль

6,72±0,58

190,5±16,3

873,6±57,4

Примечание: * различия достоверные р<0,05

Сходная динамика активности ферментов микросом отмечалась и под влиянием других исследуемых ксенобиотиков. Олигоэфир Л-1601-250 «Б» в 1/10 и 1/100 ЛД50повышал активность О-деметилазы на 176,8% и 119,65%, НАДФ·Н–цитохром С – редуктазы  – на 90,66% и 38,85% и НАД·Н–цитохром  С – редуктазы – на69,8% и 57,5%. Олигоэфир Л-1601-2-50 «Р» в этих дозах увеличивал, соответственно, активность О-деметилазы на 145,9% и 100,3%, НАДФ·Н–цитохром  С – редуктазы – на 70,4% и 49,8% и НАД·Н–цитохром  С  – редуктазы – на74,4% и 62.1%.

Исследования показывают, что влияние олигоэфиров на изучаемые показатели является дозозависимым. Во всех случаях бóльшая доза (1/10 ЛД50) вызывала более выраженный эффект, чем меньшая (1/100 ЛД50), а минимальная доза (1/1000 ЛД50) была неэффективной.

Полученные данные также свидетельствуют о том, что олигоэфиры являются индукторами гидроксилирующеймонооксигеназной системы микросом гепатоцитов, что может иметь защитно-приспособительный характер. Вместе с тем, это может иметь и вредные последствия, которые заключаются в усилении токсификации организма, активации канцерогенеза, нарушении обмена витаминов, гормонов, возникновении порфирий[1 – 3]. Известно, что индукция или блокирование активности метаболизирующих ферментов эндоплазматической сети, митохондрий, пероксисом, лизосом может существенно влиять на превращение ксенобиотиков в организме и развитие патологических явлений, которые всегда сопряжены с усилением процессов старения [1 – 4].

Под влияниеммалых доз олигоэфиров также значительно увеличивалась скорость эндогенного дыхания, окисления НАДФ·Н(без и в присутствии ЭДТА) и перекисного окисления липидов.

Так, при воздействии Л-501-2-100, Л-1601-2-50 «Б» и Л-1601-2-50 «Р»в дозе 1/100 ЛД50скорость эндогенного дыхания  повышалась,соответственно, на214,8%, 166,7% и 125,9%. Скорость окисления НАДФ·Н возрасталана - 71,5%, 67,09% и 58,86%, скорость окисления НАДФ·Н в присутствии ЭДТА – на100,1%, 83,93% и 73,93%,скорость перекисного окисления липидов – на453,8%, 438,5% и 217,9%(табл. 2).

Полученные результаты свидетельствуют, в частности, об усилении свободнорадикальных процессов, накоплении активных форм кислорода и возможном развитиисвободнорадикальной патологии при действии на организм олигоэфиров.

Таблица 2

Потребление кислорода микросомами печени под воздействием олигоэфиров в дозе 1/100 ЛД50

Показатели

Группа животных, М±m

Контроль

Л-501-2-100

Л-1601-2-50 «Б»

Л-1601-2-50 «Р»

Скорость эндогенного дыхания (нмоль О2)

1,35±0,26

4,25±0,47*

3,60±0,54*

3,05±0,43*

Скорость окисления НАДФ·Н(нмоль О2)

3,16±0,37

5,42±0,63*

5,28±0,46*

5,02±0,64*

Скорость окисления НАДФ·Н в присутствии ЭДТА(нмоль О2)

2,80±0,43

5,60±0,54*

5,15±0,37*

4,87±0,54*

Скорость перекисного окисления липидов (нмоль О2)

0,39±0,08

2,16±0,18*

2,10±0,35*

1,24±0,11*

Примечание: * различия достоверные р<0,05

Исследуемые олигоэфиры  в малых дозах также повышали содержание цитохромов в микросомах. Так, уровень цитохрома Р450увеличивалсяна 63,9%,73,2% и 41,24%, цитохрома в5– на74,6%, 85,8% и 90,1%, соответственно при введении Л-501-2-100, Л-1601-2-50 «Б» и Л-1601-2-50 «Р»(табл.3).

Таблица 3

Влияние олигоэфиров в дозе 1/100 ЛД50 на содержание микросомальныхцитохромов (нмоль/мг белка)

Показатели

Группа животных, М±m

контроль

Л - 501-2-100

Л-1601-2-50 «Б»

Л-1601 -2-50 «Р»

Цитохром Р450

0,9700,035

1,5900,17

1,6800,14

1,3700,12

Цитохром в5

0,6500,027

1,1350,08

1,2080,07

1,2350,14

Примечание: * различия достоверные р<0,05

 

Полученные результаты свидетельствуют о повышении активности не только начальных(НАДФ·Н-, НАД·Н-редуктазы), но и терминальных (цитохромы Р450, в5) участковсистемы микросомального окисления.

Выводы. Исследуемые олигоэфиры в малых дозахявляются индукторами микросомальнойгидроксилирующеймонооксигеназной системы гепатоцитов.Их действие сопряжено с активацией свободнорадикальных процессов и возможным развитием мембранной молекулярной патологии, которая лежит в основе многих патологических процессов. При этом обнаруживается выраженная дозозависимость влияния олигоэфиров. Бóльшая доза (1/10 ЛД50) вызывает более выраженный эффект, чем меньшая (1/100 ЛД50), а минимальная доза (1/1000 ЛД50) является неэффективной.

 

 

Литература:

1.     Циганенко А.Я., Щербань Н.Г., Бондаренко Л.А. и др. Методические основы регламентации сложных смесей триэтаноаминовых солей алкилфосфатов и алкилполифосфатов в воде водоемов. – Белгород, 2001. – 178 С.

2.     Жуков В.И., Мясоедов В.В., Козин Ю.И. и др. Детергенты – модуляторы радиомиметических эффектов. – Белгород, 2000. – 375 С.

3.     Попова Л.Д., Жуков В.И., Мясоедов В.В. Олигоэфиры – модуляторы радиомиметических эффектов // Медицина сегодня и завтра. ХГМУ. – 2004. - №4. – С.51-59.

4.     Жуков В.И., Кратенко Р.И., Резуненко Ю.К. и др. Медико-биологические аспекты проблемы охраны водных объектов от загрязнения поверхностно активными веществами. – Харьков, 2000. – 397 С.

5.     Агзамова Г.С. Терапевтические аспекты хронических гепатитов, возникающих от воздействия химических веществ /Г.С. Агзамова // Профессия и здоровье: материалы IV Всерос. конгресса. – М., 2005. – С. 171-173.