Биологические науки/8. Физиология человека и животных

Шевкун Н.А., Сяткин С.П. д.б.н., Демуров Е.А. д.м.н.

Российский Университет Дружбы Народов (РУДН), Медицинский факультет.

117198 Россия, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

Фотодинамическая терапия меланомы у мышей с применением векторного транспортера и фотосенсибилизатора бактериохлоринового ряда.

Поиск новых методов доставки лекарств, которые позволили бы значительно повысить эффективность применения традиционных терапевтических подходов, является важнейшей задачей современной биологии и медицины. Широкий спектр применяемых в клинике веществ, таких как фотосенсибилизаторы (ФС), α-эмитеры, нуклеиновые кислоты, относится к локально действующим, т. к. радиус их активности ограничен несколькими десятками нм. Накопленные знания о процессах внутриклеточного транспорта макромолекул в совокупности с известными биологическими особенностями раковых клеток позволили разработать уникальную систему адресной доставки терапевтических агентов.

Цель данной работы: оценка эффективности применения конъюгата ФС бактериохлорина с векторным транспортером для фотодинамической терапии (ФДТ) экспериментальных опухолей у мышей.

Рекомбинантный полипептид (векторный транспортер) His₆-ДТокс-HMP- СЯЛ-aМСГ (70,4 кДа) для направленного транспорта ФС в ядра раковых клеток-мишеней состоит из нескольких структурно-функциональных модулей [1]: − лиганда к интернализуемому рецептору, сверхэкспрессированному на клетках меланомы (последовательности a-меланоцитстимулирующего гормона aМСГ); − модифицированного сигнала ядерной локализации (СЯЛ) большого Т-антигена вируса SV-40 для направления транспорта конструкции в ядро клетки клетки; − носителя для ФС - гемоглобиноподобный белок E.coli (HMP); − эндосомолитического модуля (транслокационный домен дифтерийного токсина ДТокс). Попав в клетку путем рецептор-опосредованного эндоцитоза, транспортер оказывается «замурованным» в эндосомах. Задачу выхода из замкнутых везикул в гиалоплазму выполняет данный участок белка, активизирующийся при низких значениях рН.

Фотодинамическая терапия рака (ФДТ) в экспериментах in vivo является одним из методов, позволяющих продемонстрировать эффективность применения транспортеров для доставки докально-действующих веществ в ядра клеток-мишеней [2]. Фотосенсибилизаторы (ФС), накопившись в опухолевых клетках, при последующем световом облучении вызывают их гибель путем генерации активных форм кислорода и свободных радикалов. В медицине ФДТ широко применяется при лечении злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний [3]. Эффективность фотодеструктивного действия зависит от локализации ФС внутри клетки.

В данной работе для изучения фотодинамической активности ФС бактериохлорина р, доставляемого траспортером, использовали мышей линии C57/Black с привитой сингенной меланомой B16-F1.

Транспортер был получен путем индуцированной экспрессии в трансформированных клетках E.coli. Выделение и очистка рекомбинантного белка производилась методом аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе. Белково-хромофорные коньюгаты транспортер-ФС получали путем формирования амидных связей между карбоксильными группами ФС и аминами протеина с использованием N-гидрокси-цукцинимида и водорастворимого карбодиимида в качестве активаторов. Для проведения ФДТ меланомы у мышей C57Bl6на 4-ые сутки после инокуляции опухоли (0.5 млн клеток B16F1) животных разделили на 3 группы – контроль, инъекция 500 мкл 91,2 мкМ раствора бактериохлорина или аналогичной дозы бактериохлорина в составе конъюгата с транспортером. Через 3 ч мышей облучали с помощью иллюминатора с интерферренционным фильтром (максимум пропускания при 761 нм) 16 мин при удельной мощности светового потока 380 мВт/см². Сеансы фотодинамической терапии проводили 5 раз, на 4, 6, 8, 11 и 13-е сутки после инокуляции меланомы. Задержку роста опухоли оценивали по разнице времени достижения опухолью размера контрольной на логарифмической фазе роста.

В результате проведения ФДТ с применением внутривенного введения конъюгата транспортер-бактериохлорин в экспериментах на мышах установлено, что снижение скорости роста опухоли у мышей с конъюгатом составило 18 ± 0,6 дней по сравнению с контрольной группой животных, а продолжительность жизни увеличилась в два раза (Рис. 1). Развитие опухолей в контроле и после ФДТ с использованием свободного ФС отличается незначительно.

Рис.1. Кинетика роста меланомы B16-F1 (А) и динамика смертности (Б) у мышей C57/Black после многократной ФДТ.

Таким образом, продемонстрирована эффективность применения направленной доставки препаратов в клетки опухолей in vivo с применением векторных транспортеров.

Литература:

1. Соболев А.С., Розенкранц А.А., Гилязова Д.Г. Подходы к направленной внутриклеточной доставке фотосенсибилизаторов для увеличения их эффективности и придания клеточной специфичности // Биофизика. – 2004. – № 49 (2) . – с. 351-379.

2. Baumann A. Early development of therapeutic biologics // Pharmacokinetics. Current Drug Metabolism. - 2006. – №7. – p. 15-21.

3. Dolmans D.E., Fukumura D., Jain R.K. Photodynamic therapy for cancer // Nat. Rev. Cancer. – 2003. – №3. – p. 380-387.