Ниязалиева Д.С., к.в.н. Бабак
В.А., Пунтус И.А., к.б.н Тен О.А., к.х.н. Балпанов Д.С.
Филиал РГП «Национальный центр
биотехнологии», КН МОН Республики Казахстан в г.Степногорск, e-mail: ipbncbrk@mail.ru
ПОЛУЧЕНИЕ
ПЕРВИЧНЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК ТЯ И ПО
И ПОДБОР ОПТИМАЛЬНЫХ РОСТОВЫХ СРЕД
Первичную культуру клеток
тестикул ягненка (ТЯ) получали от ягнят 1-2 месячного возраста, почки овцы (ПО) – от овец двух месячного возраста. Для получения клеток ТЯ после убоя отрезали мошонку, извлекали тестикул. В
чашке Петри разрезали белочную оболочку, вылущивали паренхиму тестикула. Ткань
промывали раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин по 300
ЕД/мл) до просветления раствора. Отмытые клетки в растворе Хенкса, сливали и
центрифугировали (1000 об/мин 10 мин). К отмытым кусочкам тестикул добавляли
раствор трипсина (1:10) и
трипсинизировали ткань при +370С дробно по 5-7 минут
(поочередно раствором трипсина и раствором Хенкса до полного истощения тканей).
После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, а осадок
ресуспензировали в ростовой питательной среде.
Для получения первичных клеток
ПО почки помещали в эмалированный кювет, фламбировали, удаляли капсулу, срезали
корковый слой каждой доли почки,
измельчали до кусочков величиной
1-3 мм и отмывали раствором Хенкса с антибиотиками (пенициллин и стрептомицин
по 300 ЕД/мл). Трипсинизировали ткани раствором трипсина (1:10) при 370С
40-60 мин, затем проводили дезагрегацию тканей на шуттель-аппарате с подогревом
дробно: через каждые 15 минут, сливая суспензию клеток. Полученную суспензию
центрифугировали (1000 об/мин 10 мин), надосадок сливали, а осадок
ресуспензировали в ростовой питательной
среде. На каждом этапе работ проводили контроль стерильности.
Для культивирования первичных клеток в подборе сред
использовали синтетические питательные среды ИглаМЕМ, ДюльбекоМЕМ, 199 и
гидролизатные ферментативные - ФГМ-С и ГЛА.
На каждом варианте питательной среды использовали нормальную сыворотку крови
крупного рогатого скота , проверенную на ростовые свойства. После смешения
компонентов, добавления антибиотиков и сыворотки крови КРС в объеме 10%,
проводили коррекцию рН питательной среды до 7,15-7,2 стерильным раствором
бикарбоната натрия. В опыты засевали по 3 матраса РУ с каждым вариантом
испытуемой среды (по 150 мл). Каждые 12 часов наблюдали за состоянием монослоя.
Количество
клеток, индекс пролиферации и
процент жизнеспособных клеток определяли в последний день цикла, по подсчету
клеток в камере Горяева с 0,5% раствором трипанового синего, пересчитывая
концентрацию клеток по общепринятой методике.
Ростовые свойства первично-трипсинизированной почки
овны на испытуемых опытных питательных средах приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Ростовые свойства
первично-трипсинизированной почки овцы
|
Компоненты среды |
Посевная концентрация тыс.кл./мл |
Полнота формирова-ния монослоя на 4 сутки, % |
Выход клеток с матраса, млн |
Индекс пролифе- рации |
|
ДМЕМ |
1000 |
30-50 |
142-171 |
0,9-1,1 |
|
199 |
1000 |
20-40 |
126-157 |
0,8-1,0 |
|
ИглаМЕМ |
1000 |
30-50 |
138-165 |
0,9-1,1 |
|
ФГМ-С |
1000 |
50-60 |
161-178 |
1,1-1,2 |
|
ГЛА |
1000 |
50-70 |
167-183 |
1,1-1,22 |
|
ИглаМЕМ:ГЛА
(1:1) |
1000 |
80-100 |
225-260 |
1,5-1,7 |
|
ФГМ-С+ДМЕМ (3:1) |
1000 |
70-80 |
195-212 |
1,3-1,4 |
Оптимальной для
культивирования первичных клеток ПО показала среда 0,5% ГЛА:Игла (1:1) с
добавлением 10% сыворотки КРС. При посевной концентрации 1000 тыс.кл/мл к 4
суткам формировался 100% монослой смешанного типа с преобладанием
эпителиоподобных клеток, пригодный для инфицирования вирусом. При засеве
матрасов в концентрации 600 тыс.кл/мл
полный монослоой формировался на 5-е сутки.
Аналогичные
исследования были проведены и по подбору оптимальной ростовой питательной среды
для культуры первично-трипсинизированных тестикул ягненка. Данные опытов
приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Ростовые
свойства первично-трипсинизированных тестикул ягненка
|
Компоненты среды |
Посевная концентрация, тыс.кл./мл |
Полнота формирова-ния монослоя на 4-5 сутки, % |
Выход клеток с матраса, млн |
Индекс пролифе- рации |
|
ДМЕМ |
600 |
30-50 |
115-127 |
1,28-1,41 |
|
199 |
600 |
30-40 |
104-116 |
1,15-1,29 |
|
ИглаМЕМ |
600 |
30-50 |
112-124 |
1,24-1,37 |
|
ФГМ-С |
600 |
60-80 |
157-165 |
1,74-1,83 |
|
ГЛА |
600 |
60-70 |
137-152 |
1,52-1,69 |
|
ИглаМЕМ:ГЛА (1:1) |
600 |
80-90 |
170-177 |
1,89-1,97 |
|
ФГМ-С+ДМЕМ
(3:1) |
600 |
90-100 |
175-189 |
1,95-2,1 |
Для культивирования
первичной культуры ТЯ наиболее оптимальной оказалась комбинированная среда 0,3%
ФГМ-С+ДМЕМ в соотношении 3:1 с добавлением 10% сыворотки крови КРС. При рассеве
первичых клеток ТЯ в концентрации 600 тыс.кл/мл полный монослой формировался на
3 сутки, при рассеве в концентрации 400 тыс.кл/мл - на 5 сутки. Пятисуточную
культуру использовали для проведения однократного субпассажа с кратностью
пересева 1:2 на той же питательной среде с добавлением 10% сыворотки крови КРС.
При этом полный монослой формировался также на третьи сутки, клетки сохраняли
свою первичную морфологию и были пригодным для заражения. Проведение повторного
субпассажа клетки не выдерживали и начинали проявлять признаки дегенерации
(вакуолизация и с последующей гибелью клеток).
Литература:
1. Адамс, Р.М. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адамс. – М.: Мир, 1983.
– 263 с.
2. Бакулов И.А. Эпизоотология с микробиологией. М. // "Агропромиздат" - 1987. – 415 с.
3. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре (методы и применение в
биотехнологии) // Под общ.ред. проф. Дьяконов Л.П. – М. : Издательство «Спутник+». - 2009. –
656 с.
4. European Pharmacopoeia. 6th Edition.European
Directorate for the Quality of Medicines (EDQM). – Council of Europe, 67075
Strasbourg, France.- 2007. – 3308 p.
5. В.М.Жавненко и др. Практикум по вирусологии / Под ред.
В.М. Жавненко; // Минск : Дизайн ПРО.- 1998. – 144
с.