Кургамбаева Г.С., к.в.н. Бабак В.А., к.б.н. Тен О.А., к.х.н. Балпанов Д.С. Гусев А.А., д.в.н., Пунтус И.А.

Филиал РГП на ПХВ «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан», КН МОН РК в г. Степногорск, e-mail: ipbncbrk@mail.ru

ОТРАБОТКА ОПТИМАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ ВЫРАЩИВАНИЯ ПЕРЕВИВАЕМЫХ

КЛЕТОК ПОЧКИ СИРИЙСКОГО ХОМЯЧКА

Внедрение лабораторных технологий изготовления вакцин в производство невозможно без процессов изучения технологических параметров культивирования клеток и вирусов, масштабирования процесса и его валидации. Целью наших исследований было изучение оптимальных технологических параметров культивирования клеток ВНК-21 и ВНК-21(сl-13) стационарным, роллерным, роллерно-суспензионным методами культивирования.

На базе лаборатории вирусных препаратов были отработаны параметры работы с культурой клеток ВНК-21 в стационарном монослое, при этом была подобрана полусинтетическая обогащенная питательная среда ФГМ-С+ДМЕМ (3:1) + D-глюкоза 4000мг/л, + L-глутамин 150–300 мг/л и синтетическая ИглаМЕМ+199 + 10% сыворотки КРС. Получили следующие оптимальные условия стационарного культивирования клеток ВНК-21: температура +37±0,1^оС, 5-суточные циклы пересевов, питательная среда ИглаМЕМ+199 или ФГМ-С+ДМЕМ (3:1), кратность рассева 1:7 или посевная концентрация 50–100 тыс.кл/мл, метод снятия клеток - версен+трипсин (9:1). При накоплении клеток в матрасах РУ объемом 1500 мл (S≈260 cm²) выход составил 81,0±9,5 млн.кл./матр. (ИП=7,3-10,4).

Рисунок 1 - Матрасы с культурой клеток ВНК-21, стационарное культивирование

Роллерное культивирование клеток ВНК-21 проводили в стеклянных роллерных флаконах объемом 2,0 л (S≈800 cm²) – выход клеток составил 157,8±30,9 млн.кл./рол., и 253,8±38,4 млн.кл./рол. с 3-х литровых сосудов (S≈1200 cm²) (ИП=11,0-15,0), при этом посевная концентрация составляла 70–100 тыс.кл/мл. Культивирование проводили в термальной комнате при +37±0,2^оС и постоянном вращении роллерных флаконов со скоростью 0,25-0,5 об/мин, пятисуточными циклами, метод снятия версен+трипсин (9:1). В сравнительном аспекте роллерное культивирование монослойной лини ВНК-21 в 2,0-2,5 раза эффективнее стационарного при тех же затратах питательных сред и реактивов.

Рисунок 2 – Роллеры с культурой клеток ВНК-21(сl-13), объемом 2, 3, 4 литра

Стационарное культивирование клеток ВНК-21(сl-13) на питательной среде ФГМ-С+ДМЕМ показало, что формирование монослоя клоном клеток сl-13 происходит быстрее, чем монослойной линией (ВНК-21). При накоплении клеток в матрасах объемом 650 мл (S=175 cm²) получали выход клеток 43,3±6,2 млн.кл/матр. (ИПА=12,0-16,2), в матрасах РУ объемом 1500 мл (S≈260 cm²) выход составил 86,0±11,7 млн.кл./матр. (ИПА=14,0-17,4). Следует отметить, что несмотря на небольшую разницу в численном выходе клеток ВНК-21 и ВНК-21(сl-13), которые составили 81,0±9,5 и 89,5±11,7 млн.кл./матр соответственно, ИПА у культуры ВНК-21(сl-13) при стационарном культивирование был выше в 1,5-2,5 раза.

Роллерное культивирование ВНК-21(сl-13) проводили по технологии масштабирования в роллерных флаконах объемом 2,0 л (S≈800 cm²), получали средние выходы 290,0±36,40 млн.кл./рол., 3,0 л (S≈1200 cm²) – 428±42,90 и 535,0±65,3 млн.кл./рол., с 4-х литровых сосудов (S≈1600 cm²) (ИП=25,0-35,0). Дальнейшее направление масштабирования было связано с использованием 3-х литровых рифленых роллерных сосудов, которые при тех же объемах имеют в 2-3 раза большую площадь роста. В сравнительном аспекте роллерное культивирование клеток ВНК-21(сl-13) в 3,0-3,5 раза эффективнее стационарного метода при тех же затратах питательных сред, реактивов и трудоресурсов.

Отработана методика роллерного монослойно-суспензионного метода культивирования для накопления биомассы клеток ВНК-21(сl-13) в роллерах для последующей заправки биореактора. Данная методика позволила увеличить выход клеток в 2,5–5 раз по сравнению с базовым вариантом роллерного культивирования, при этом получали до 940–1210 млн.кл/рол., культивируя клетки ВНК-21(сl-13) по разработанной схеме: исходная концентрация клеток – 100 тыс.кл/мл; объем среды – 400 мл/рол; скорость вращения флаконов – 1,0–2,5 об/мин. Полученные роллерно-суспензионным способом клетки ВНК-21(сl–13) были испытаны при загрузке биореактора для культивирования клеток суспензионным способом.

Литература:

1. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адамс. – М.: Мир, 1983. – 263 с.

2. Блажевич, О.В. Культивирование клеток: Курс лекций / О.В. Блажевич. – Мн. : БГУ, 2005. – 78 с.

3. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре / Л.П. Дьяконов, В.И. Ситьков. – М. : Компания Спутник+, 2000. – 400 с.

4. Культивирование клеток и тканей животных / Л.П. Дьяконов [и др.]; под общ. ред. Л.П. Дьяконовa. – Ставрополь : Ставроп. Правда, 1988. – Ч. 2. – 91 с.

5. Культуры животных клеток // Культивирование клеток // Системы культивирования клеток [Электронный ресурс] / Основы биотехнологии. – 2006. – Режим доступа : http://biotechnolog.ru. – Дата доступа : 20.06.2013.

6. Фрешни, Р. Культура животных клеток. Методы / Р. Фрешни. – М. : Мир, 1989. – 318 с.

7. Doyle, A. Cell and tissue culture: laboratory procedures in biotechnology / A. Doyle, J.B. Griffiths. – 1998. – 332. p.

8. Jakoby, W.B. Cell Culture / W.B. Jakoby, I.H. Pastan. – 2004. – p. 639.