Ниязалиева Д.С., к.в.н. Бабак В.А., Пунтус И.А., к.б.н Тен О.А., к.х.н. Балпанов Д.С.

Филиал РГП «Национальный центр биотехнологии», КН МОН Республики Казахстан в г.Степногорск, e-mail: ipbncbrk@mail.ru

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ НАКОПЛЕНИЯ

ПЕРЕВИВАЕМЫХ КУЛЬТУР КЛЕТОК 3КГ, ЯДК-04 И ПО-2

Разработка современных технологий изготовления вакцин невозможна без усовершенствования процессов получения клеток и вирусов, процессов их масштабирования.

Целью наших исследований являлся подбор наиболее оптимальных питательных сред и условий культивирования перевиваемых культур клеток 3КГ, ЯДК-04 и ПО-2, чувствительных к вирусу оспы овец.

Для проведения исследований использовали перевиваемые клеточные линии 3-КГ (гонады козы), ЯДК-04 (яичник домашней козы) и ПО-2 (почка овцы), согласно литературным данным, чувствительные к вирусу оспы овец.

Культура клеток 3-КГ представляет собой фибробластоподобные полигональные клетки. На сформированном монослое культура представляет собой веретеновидно переплетенные клетки с округлым ядром. Первично полученная культура клеток 3-КГ культивировалась на полусинтетической питательной среде ПСС и добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.

Культура клеток ЯДК-04 представляет собой эпителиоподобные клетки. На сформированном монослое культура представляет собой веретеновидно переплетенные клетки. Среда культивирования согласно по паспорту - ИглаМЕМ.

Перевиваемая культура клеток ПО-2 представляет собой эпителиоподобные клетки. Среда культивирования согласно паспортным данным ИглаМЕМ.

Для адаптации культур клеток использовали синтетические среды ИглаМЕМ, 199, ДМЕМ и ферментативные ФГМ-С и ГЛА в различных сочетаниях основных компонентов. Адаптацию к сыворотке крови КРС проводили в течение последовательных 4-х пассажей, заменяя эмбриональную сыворотку крови КРС пошагово на 30, 50, 70 и 100 %. Во всех вариациях сред использовали добавление 10% сыворотки крови КРС, антибиотики – пенициллин и стрептомицин в дозе 100 ЕД/мл и корректирующий рН 7,57% раствор бикарбоната натрия. В качестве компонентов обогащения питательных сред использовали D-глюкозу (до 2000 мг/л) и L-глютамин (100-150 мг/л).

Культивирование клеток проводили по общепринятой методике. Процесс адаптации перевиваемых линий к монослойному культивированию в роллерах проводили в течении 3-х пассажей с использованием стеклянных роллерных сосудов (V=2000 см³) в термальной комнате при температуре +37,0±0,2ºС со скоростью вращения флаконов - 0,2-0,3 об/мин. на роллерной установке.

При работе использовались общепринятые методики трипсинизации клеток, их подсчета и рассева с соблюдением правил работы в стерильных боксовых помещениях.

Для определения количества клеток, индекса пролиферации и процента жизнеспособных клеток ежедневно снимали по три матраса или роллера в течение 7 дней и проводили подсчет клеток в камере Горяева, используя 0,5% водный раствор трипанового синего по общепринятым методикам.

Каждые 12 ч проводили микроскопирование исследуемой линии, оценивая состояние культуры, морфологию, формирование клеточного монослоя.

Для каждой из перевиваемой линии культур клеток отрабатывались методики обогащения ростовой питательной среды.

В ходе опытов подобраны оптимальные модифицированные ростовые питательные среды: для 3-КГ - ФГМ-С+ДМЕМ (3:1), обогащенная глюкозой и глютамином в дозировках 0,2 г/л и 100-150 мг/л соответственно и раствором витаминов 2%.

Для линий клеток ЯДК-04 и ПО-2, обогащение глюкозой и глютамином напротив вело к незначительному снижению пролиферативной активности клеток, поэтому среду ИглаМЕМ+ДМЕМ обогащали лишь комплексом стабилизированных аминокислот ВМЕ в концентрации 1%. Во всех случаях для ростовых питательных сред использовалось обогащение среды 10% нормальной сыворотки крови крупного рогатого скота для максимального накопления клеток. Жизнеспособность клеток во всех вариантах культивирования составляла 97-99%.

Отработаны параметры культивирования перевиваемых клеточных линий 3-КГ, ЯДК-04, ПО-2 - посевные концентрации для ведения в пассажах (3-КГ и ЯДК – 100-120 тыс.кл./мл., ПО-2 – 65-80 тыс.кл./мл), определены циклы культивирования и индексы пролиферативной активности, жизнеспособность, подобраны оптимальные посевные концентрации для получения полного монослоя через 48-72 часа для заражения вирусом оспы (3-КГ и ЯДК – 170-130 тыс.кл./мл., ПО-2 – 120-100 тыс.кл./мл), изучены морфологические и ростовые признаки культур.

Перевиваемые линии 3-КГ, ЯДК-04 и ПО-2 адаптированы к роллерному методу накопления биомассы клеток, позволяющий получать большее количество клеток при наименьших затратах питательных сред. Для каждой линии подобраны оптимальные посевные концентрации: для пассажей – 3-КГ и ЯДК – 28-35 млн.кл./рол., ПО-2 – 25-30 млн.кл./рол; для получения монослоя через 48 часов - 3-КГ и ЯДК – 50-56млн.кл./рол., ПО-2 – 45-50 млн.кл./рол., скорость вращении роллеров - 0,2-0,3 об/мин.

Подготовлены технологические инструкции по пересеву перевиваемых культур клеток 3-КГ, ЯДК и ПО-2, проведено их депонирование в лабораторную клеточную коллекцию (низкотемпературное хранение -86^оС и жидкий азот -196^оС). Подготовлена технологическая инструкция по криоконсервированию перевиваемых культур клеток.

Литература:

1. Адамс, Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Р. Адамс. – М.: Мир, 1983. – 263 с.

2. Абдураимов, Е.О., Изучение свойств вируса оспы коз в клеточных культурах Е.О. Абдураимов, М.М. Мамбеталиев, Л.Б, КутумбетовАктуал. пробл. с.-х. биотехнологии: матер, конф. Гвардейский, 1998. С. 9-11.

3. Бакулов И.А. Эпизоотология с микробиологией. М.: "Агропромиздат", 1987. – 415 с.

4. Блажевич, О.В. Культивирование клеток: Курс лекций / О.В. Блажевич. Мн.: БГУ, 2005. – 78 с.

5. Дьяконов, Л.П. Животная клетка в культуре (методы и применение в биотехнологии) / Под общ.ред. проф. Дьяконов Л.П. – М. : Издательство «Спутник+», 2009. – 656 с.

6. Основы биотехнологии: культивирование клеток человека и животных. Учебно-методическое пособие. – Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2005. – 48 с.

7. Инфекционные болезни животных / Б.Ф. Бессарабов, А.А., Е.С. Воронин и др.; Под ред. А. А. Сидорчука. - М.: КолосС, 2007. - 671 с.

8. Особо опасные болезни животных И.А. Бакулов, В.М. Котляров, Т.А. Власова [и др.]. - Покров: ВНИИВВиМ, 2002. – С. 97-106.

9. Российская коллекция клеточных культур позвоночных (РККК П) [Электронный ресурс]. – Электрон.текстовые данные и прогр. (2,33 Мб). – 1 электрон. опт. диск (CD-ROM).

10. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. М.: ВНИТЖП, 1998. - 928 с.