Кучеренко В.П., Жуков В.І., Бондарева А.В.

Харківський національний медичний університет (м. Харків)

ВПЛИВ ПОЛІОКСИПРОПІЛЕНГЛІКОЛЮ МОЛЕКУЛЯРНОЇ МАСИ 2100 НА СТРУКТУРНО-МЕТАБОЛІЧНУ ФУНКЦІЮ ПЕЧІНКИ У СУБТОКСИЧНИХ ДОЗАХ

Вступ

Інтенсивна діяльність людини на сучасному етапі розвитку науки, технології й техніки призвела до появи значної кількості хімічних токсичних речовин. Інформація щодо можливих наслідків дії останніх у багатьох випадках обмежена та недостатня. Тому виникає значний розрив між високою здатністю сучасної цивілізації створювати новий хімічний потенціал та обмеженими можливостями людини, сприйняти дію цього потенціалу з достатньою ефективністю та без серйозних негативних наслідків. На думку багатьох авторів, значна частина хімічних сполук має радіобіологічні ефекти, мембранотропну дію, викликає в організмі розвиток вільнорадикальної патології, формує імунологічну недостатність [1, 2]. У великих містах з розвинутою хімічною промисловістю провідними ризик-факторами є хімічні сполуки, що забруднюють довкілля та мають здатність формувати різні захворювання й патологічні стани. Шкідливий вплив на біосферу хімічних факторів може створювати загрозу життю й здоров’ю майбутніх поколінь, формуючи мутагенні, канцерогенні, генотоксичні ефекти [3, 4]. Підвищення антропогенного хімічного навантаження на організм змінює імунобіологічну реактивність мешканців населених міст, включаючи й дитяче населення. Усе це призводить до розладів основних регуляторних систем організму, масового зростання захворювань, генетичних порушень та інших змін, об’єднаних поняттям «екологічна патологія» [1, 2].

Забруднення оточуючого середовища вносить значний вклад до формування донозологічних і патологічних станів. У їх розвитку важливу роль відіграють універсальні механізми порушення гомеостатичної функції організму, до яких належать активація вільнорадикального окислення, перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), зниження системи антиоксидантного захисту, біоенергетичних процесів, детоксикаційної функції, кооперативної взаємодії клітинного та гуморального імунітету [1, 2].

Метою роботи було дослідження метаболічного стану печінки в умовах тривалої субтоксичної дії поліоксипропіленгліколю молекулярної маси 2100 на організм щурів.

Матеріали та методи дослідження

У роботі використаний поліоксипропіленгліколь молекулярної маси 2100 з реглементованими фізико-хімічними властивостями, що має технічну назву «Лапрол» – Лп-2102. За агрегатним станом Лп-2102 є в’язкою прозорою рідиною, добре розчинною у воді й органічних розчинниках. Вибір Лп-2102 обумовлений великими обсягами виробництва, широким контактом з населенням, відсутністю прогнозу потенційної безпеки для теплокровних тварин, необхідністю дослідження патохімічних механізмів структурно-метаболічних порушень в організмі під впливом субтоксичних доз. Програма дослідження передбачала проведення тривалого підгострого експерименту (60 діб) на білих щурах популяції Вістар. Тварини протягом усього періоду токсифікації пероральним шляхом отримували 1/10, 1/100 й 1/1000 середньолетальної дози (ДЛ₅₀) Лп-2102. Речовину у вигляді водних розчинів вводили внутрішньошлунково за допомогою металевого зонда щоденно вранці. Контрольна група тварин отримувала відповідні об’єми питної води. Відповідно до результатів гострого досліду Лп-2102 відноситься до помірно токсичних сполук; ДЛ₅₀ встановлена на рівні 1,45 г/кг маси щурів [4]. У кожній експериментальній групі було по 10 щурів. Усі етапи наукового експерименту виконувалися відповідно до сучасних принципів біоетики.

Метаболічний стан печінки оцінювався після тривалої інтоксикації щурів Лп-2102. Вивчалася детоксикаційна функція, стан оксидантно-антиоксидантної системи, динамічні зміни показників білкового, ліпідного, вуглеводного й нуклеїнового обміну. Детоксикаційна функція печінки оцінювалася за активністю УДФ-глюкуронілтрансферази (УДФ-ГТ), арилсульфотрансферази (АСТ), N-ацетилтрансферази (N-АТ), глутатіон-S-трансферази (Г-S-Т) та вмістом КоА. Активність УДФ-ГТ та АСТ мікросомальної фракції печінки оцінювалася за швидкістю кон’югації пара-нітрофенолу [5-8], N-АТ у постмітохондріальній фракції – за швидкістю кон’югації пара-амінобензойної кислоти, концентрацію якої визначали за реакцією діазосполучення з нафтилетилендіаміном [9]. Активність Г-S-Т у постмітохондріальній фракції гепатоцитів оцінювалася за утворенням кон’югатів глутатіону з 1-хлор-2,4-динітробензолом [10, 11]. Сумарний вміст КоА в печінці визначали методом ацетилювання пара-амінобензойної кислоти [11]. Стан оксидантно-антиоксидантної системи оцінювався за вмістом малонового діальдегіду (МДА), дієнових кон’югатів (ДК), відновленого (Г-SH) та окисленого (Г-S-S-Г) глутатіону, а також цистеїну. Про відносний рівень вторинних продуктів ПОЛ судили по накопиченню в печінці МДА, який визначали за кольоровою реакцією з тіобарбітуровою кислотою [12]. Дієнові кон’югати визначали спектрофотометрично при 233 нм [13]. Вміст Г-SH і Г-S-S-Г визначали у глутатіонтрансферазній реакції [14]. Цистеїн визначали за реакцією з нінгідрином у трихлороцтовому фільтраті [15].

Вміст кетонових тіл у крові щурів досліджували шляхом зв’язування ацетону саліциловим методом [5]. Неестерифіковані вільні жирні кислоти визначали за екстракцією мідних солей жирних кислот у плазмі крові органічними розчинниками [6], глікоген у печінці – за методом Зейфтера [6], сумарну рибонуклеїнову кислоту (РНК) – фенольно-термічним методом [16], Ядра з печінки білих щурів виділяли за методом D.M. Caill [17], гістони – за методом E.W. Johns, A.V. Butter [18], глобуліни – за методом Б.И. Збарського та Г.П. Георгієва [19]. Активність глюкозо-6-фосфатази (Г-6-Ф) у печінці визначали за методом А.А. Покровського і А.Н. Арчакова [21], вміст холестерину, глюкози, креатиніну та сечовини, активність аспарагінової амінотрансферази (АсАТ), аланінової амінотрансферази (АлАТ) і триптофан-2,3-діоксигенази (Т-2,3-ДОГ) – загальноприйнятими методами [5, 6, 20]. Отримані результати оброблялися методами варіаційної статистики з оцінкою вірогідності за Стьюдентом-Фішером.

Результати дослідження та їх обговорення

Дослідження впливу Лп-2102 в 1/10 ДЛ₅₀ на щурів показало зниження у мікроcомах гепатоцитів активності УДФ-ГТ на 58,8%, а в 1/100 ДЛ₅₀ - підвищення на 28,06% (табл. 1). Така ж динаміка активності спостерігалася й для N-АТ у постмітохондріальній фракції гепатоцитів. У 1/10 ДЛ₅₀ активність фермента знижувалася на 36,37%, а в 1/100 ДЛ₅₀, навпаки, зростала на 113,63%. Активність АСТ у мікросомах гепатоцитів під впливом 1/10 ДЛ₅₀ знижувалася на 51,27% та пiдвищувалась у тварин, токсифікованих 1/100 ДЛ₅₀ на 80,48%. Цi результати вказують, що Лп-2102 у дозі 1/100 стимулює метаболiчнi процеси, пов'язанi з утворенням глюкуронідної, ацетильної й сульфатної кон’югації, тоді як при дії 1/10 ДЛ₅₀ їх синтез значно гальмується.

Загальний вміст у печінці КоА зростав як під впливом 1/10 ДЛ₅₀, так і 1/100 ДЛ₅₀, відповідно на 226,9 і 129,9%, що може бути поєднано з активацією захисно-пристосувальних механізмів забезпечення гомеостатичної функції печінки й відновлювальних синтезів. Глутатіон-3-трансферазна активність у постмітохондріальній фракції гепатоцитів знижувалася на 65,4 і 42% як під впливом 1/10 ДЛ₅₀, так і 1/100 ДЛ₅₀.

Порушення активності кон’югуючих ензимів поєднано з вмістом у печінці глюкуронідів і сульфатів. Дослідження показали зниження вмісту в печінці загальних, зв'язаних і вільних глюкуронідів відповідно на 41,9, 55,2 і 27,8% під впливом 1/10 ДЛ₅₀, а в групах, токсифікованих 1/100 ДЛ₅₀, – на 29,4, 37,9 і 20,2%. Оцінка вмісту сульфатів у печінці виявила зниження загальних і зв’язаних, а також підвищення вільних сульфатів як під впливом 1/10, так і 1/100 ДЛ₅₀. У найбільшій мірі спостерігалося зниження зв’язаних сульфатів при 1/10 ДЛ₅₀ (на 80,3%) і при 1/100 ДЛ₅₀ (на 72,1%). Отримані результати свідчать, що Лп-2102 в 1/10 ДЛ₅₀ значно пригнічує детоксикаційну функцію печінки, тоді як в 1/100 ДЛ₅₀ викликає її активацію. В 1/1000 ДЛ₅₀ Лп-2102 не впливав на знешкоджувальну функцію печінки.

Таблиця 1

Вплив Лп-2102 в субтоксичних дозах на детоксикаційну функцію печінки при тривалій дії на щурів

Показники	Групи тварин, ДЛ50 (M±m)
	Контроль (n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
УДФ-ГТ, нмоль/хв∙мг білка	3,52±0,29	1,45±0,13*	4,86±0,13*	3,45±0,38
N-АТ, нмоль/ хв∙мг білка	0,22±0,016	0,14±0,012*	0,47±0,05*	0,23±0,017
АСТ, нмоль/хв∙мг білка	0,41±0,023	0,20±0,018*	0,74±0,08*	0,42±0,027
КоА, нмоль/г тканини	295,3±17,2	965,4±42,7*	78,9±34,3*	307,2±24,8
Г-S-Т, нмоль/хв∙мг білка	36,8±1,97	12,73±1,36*	21,35±1,28*	34,82±2,14
Загальні глюкуроніди, мкмоль/г	88,35±4,10	51,27±3,63*	62,4±2,54*	86,24±3,75
Зв’язані глюкуроніди, мкмоль/г	45,60±3,24	20,42±1,75*	28,3±2,16*	44,30±2,68
Вільні глюкуроніди, мкмоль/г	42,75±3,56	30,85±2,69*	34,1±2,35*	41,94±3,21
Загальні сульфати, мкмоль/г	1,53±0,07	0,86±0,05*	1,12±0,08*	1,55±0,08
Вільні сульфати, мкмоль/г	0,31±0,03	0,64±0,04*	0,78±0,07*	0,32±0,025
Зв’язані сульфати, мкмоль/г	1,22±0,05	0,24±0,045*	0,34±0,075*	1,23±0,05

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Загальновідомо, що активація детоксикаційної функції завжди поєднана з підвищенням процесів, пов’язаних з утворенням активних форм кисню. Дослiдження оксидантно-антиоксидантного метаболізму виявило підвищення вмісту МДА, ДК, Г-S-S-Г на тлі зниження Г-SH і цистеїну (табл. 2). Після 60-ти добової токсифікації виявлено зростання в печінці рівнів МДА на 172,1 і 90,4%; ДК – на 87,9 і 41,4%; Г-S-S-Г – на 223,3 і 116,7% на тлі пригнічення вмісту Г-SH – на 56,3 і 32,5%, а цистеїну – на 53,9 і 33,3% відповідно під впливом 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀. Ці результати вказують, що Лп-2102 стимулює ПОЛ і знижує антиоксидантну активність, сприяючи тим самим розвитку мембранної патології.

Таблиця 2

Вплив Лп-2102 на оксидантно-антиоксидантні процеси в умовах тривалої субтоксичної дії на щурів

Показники	Групи тварин, ДЛ50 (M±m)
	Контроль (n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
МДА, нмоль/мг білка	9,06±0,73	24,65±1,62*	17,25±1,43*	10,15±0,88
ДК, нмоль/мг білка	35,24±2,65	66,23±4,15*	49,84±2,57*	37,83±2,96
Г-SH, мкмоль/г	7,20±0,58	3,15±0,26*	4,86±0,42*	6,95±0,63
Г-S-S-Г, мкмоль/г	0,30±0,016	0,97±0,07*	0,65±0,06*	0,31±0,02
Цистеїн, мкмоль/г	0,39±0,012	0,18±0,014*	0,26±0,017*	0,38±0,02

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Визначення органоспецифічних і мембраноструктурованих ферментів виявило суттєве зниження активності в мікросомах гепатоцитів Г-6-Ф і Т-2,3-ДОГ, а також підвищення в сироватці крові АлАТ та АсАТ (табл. 3).

Таблиця 3

Вплив субтоксичних доз Лп-2102 на ферментативну активність

печінки та сироватки крові

Показники	Групи тварин, ДЛ50 (M±m)
	Контроль (n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
Г-6-Фаза, нмоль/ хв∙мг білка	9,63±0,85	2,48±0,27*	3,64±0,29*	9,27±0,64
АлАТ, мкмоль/л∙год	0,54±0,06	3,26±0,25*	2,95±0,23*	0,57±0,08
АсАТ, мкмоль/л∙год	0,76±0,05	4,23±0,37*	3,78±0,31*	0,74±0,06
Т-2,3-ДОГ, нмоль кінуреніну/ мг білка∙год	13,8±1,14	3,86±0,42*	5,7±0,64*	12,56±0,95

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Активність Г-6-Ф знижувалася на 74,3 і 62,2%, Т-2,3-ДОГ – на 72,0 і 58,7%, тоді як у сироватці крові активність АлАТ підвищувалася на 503,7 і 446,7%, а АсАТ – на 456,6 і 397,4% відповідно під впливом 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀. Виявлені зміни у ферментативній активності можуть свідчити про розвиток мембранної патології, дисфункцію вуглеводного обміну, процесів трансамінування амінокислот, а також про значні порушення обміну триптофану й активності триптофан-2,3-діоксигенази, які поєднані з синтезом нейромедіатору – серотоніну, гормону – мелатоніну, індуктора диференціювання та проліферації клітин – 5-оксиіндолоцтової кислоти і коферментної форми НАД⁺. Такі результати вказують на глибоку дисфункцію метаболізму в групах тварин, токсифікованих Лп-2102 у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀. У дозі 1/1000 ДЛ₅₀ Лп-2102 не впливав на ферментативну активність печінки.

Субтоксична тривала дія Лп-2102 на щурів призводила до значних порушень моніторингованих показників обміну речовин (табл. 4). Оцінка азотовмісних сполук виявила підвищення в сироватці крові креатиніну на 70,6 і 56,5%, сечовини – на 199,1 і 147,9%. Ці дані можуть вказувати на активацію білкового обміну, при якому катаболічні процеси переважають над анаболічними. У сироватці крові також спостерігалося зростання рівнів метаболітів ліпідного обміну – холестерину, вільних жирних кислот і кетонових тіл. Так вміст вільних жирних кислот підвищувався на 291,9 і 153,2%, холестерину – на 135,6 і 102,7%, а кетонових тіл – на 605,6 і 483,3% відповідно під впливом 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀, що може вказувати на активацію розпаду ліпідів, мембранну патологію й зростання оксидативних процесів. На цьому фоні відмічалося зниження концентрації глюкози в крові на 56,2 і 23,9%, а також глікогену в печінці – на 85,9 і 63,6% відповідно у щурів, токсифікованих 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀. Ці результати свідчать про розвиток енергетичного голоду, який може формувати тканинну гіпоксію і суттєві структурно-метаболічні порушення. Визначення рівнів РНК, гістонів, глобулінів (табл. 4) дає підставу стверджувати про пригнічення синтетичних і репаративних процесів.

Таблиця 4

Вплив Лп-2102 на моніторингові показники обміну речовин в умовах тривалої субтоксичної дії

Показники	Групи тварин, ДЛ50 (M±m)
	Контроль (n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
Креатинін, мкмоль/л	67,3±3,18	114,8±5,7*	105,3±4,9*	65,4±2,85
Сечовина, ммоль/л	4,63±0,25	13,76±1,38*	11,48±1,14*	4,82±0,37
Глікоген, мкмоль глюкози/г печінки	143,8±6,74	20,17±2,37*	52,35±2,68*	137,5±7,14
Вільні жирні кислоти, ммоль/л	0,62±0,07	2,43±0,18*	1,57±0,13*	0,64±0,08
Кетонові тіла, ммоль/л	0,36±0,02	2,54±0,26*	2,10±0,16*	0,38±0,018
Глюкоза, ммоль/л	4,93±0,26	2,16±0,17*	3,75±0,27*	4,85±0,33
Холестерин, ммоль/л	1,46±0,17	3,44±0,35*	2,96±0,23*	1,38±0,14
РНК, імп/хв∙мг РНК	27135,6 ±695,4	12326,4 ±208,7*	15156,2 ±268,3*	26794,8 ±583,7
Гістони, імп/хв∙мг білка	258,6±14,3	92,72±8,6*	142,7±9,5*	266,4±17,5
Глобуліни, імп/хв∙мг білка	207,5±12,7	83,8±7,6*	117,8±6,9*	214,8±15,6

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Як показали результати, вміст РНК у печінці знижувався на 54,6 і 44,1%, гістонів ядерної фракції гепатоцитів – на 64,2 і 44,8%, а глобулінів ядерної фракції печінки – на 59,6 і 43,2%.

Таким чином, результати дослідження свідчать, що поліоксипропілен-гліколь молекулярної маси 2100 (Лп-02102) в умовах тривалої субтоксичної дії в 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ здатний на 60-ту добу токсифікації призводити до пригнічення детоксикаційної функції печінки, стимулювати вільнорадикальні процеси на фоні зниження системи антирадикального й антиперекисного захисту. Активація оксидативних процесів супроводжується виснаженням антиоксидантної системи й порушеннями всіх видів обміну речовин та енергії з превалюванням катаболічних процесів над анаболічними. Недіюча доза на метаболізм печінки обґрунтована на рівні 1/1000 ДЛ₅₀.

Література

1. Щербань Н.Г. Биохимические аспекты экологической патологии, связанной с химическим загрязнением поверхностных источников водоснабжения / [Н.Г. Щербань, В.И. Жуков, В.В. Мясоедов и др.] – Харьков: «Раритеты Украины», 2011. – 176 с.

2. Щербань Н.Г. Оценка рисков здоровья населения от опасных отходов (Биохимические аспекты) / Щербань Н.Г., Жуков В.И., Мясоедов В.В. – Харьков: «Апостроф», 2010. – 156 с.

3. Жуков В.И. Фториды: биологическая роль и механизмы действия / [В.И. Жуков, О.В. Зайцева, В.И. Пивень и др.] – Белгород: «Белвитамины», 2006. – 220 с.

4. Жуков В.И. Простые и макроциклические эфиры: научные основы охраны водных объектов / В.И. Жуков, Л.Д. Попова, О.В. Зайцева и др.] – Харьков: «Торнадо», 2000. – 438 с.

5. Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике / А.А. Покровский. – М.: Медицина, 1969. – 652 с.

6. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник / Под ред. проф. В.В. Меньшикова. – М.: Медицина, 1987. – 368 с.

7. Burchell B. 4-Nitrophenol UDP–glucoronyltransferase / B. Burchell, P. Weatheril // Meth. Enzymol. – 1981. – Vol. 77. – P. 169–171.

8. Cummings J. Kinetics of microsomal glucuronidation in intact and perturbattreated membranes / J. Cummings, A.B. Graham, G.C. Wood // Biochim. Biophys. Acta. – 1984. – Vol. 771, № 2. – P. 127–141.

9. Weber W.W. N-acetyltransferase and Arylhydroxamic acid acyltransferase / W.W. Weber, G.M. King // Meth. Enzymol. – 1981. – Vol. 77. – P. 272–281.

10. Habig W.H. Assays for differentiation of glutation-S-transferase / W.H. Habig, W.B. Jacobi // Meth. Enzymol. – 1981. – Vol. 77. – P. 398–405.

11. Экспериментальная витаминология // Под ред. Ю.М. Островского. – Мінск: Наука і техника. – 1979. – 550 с.

12. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / ЮА. Владимиров, А.И. Арчаков. – М.: Медицина, 1972 . – 236 с.

13. Косухин А.Б. Экстракция липидов смесью гептан–изопропанол для определения диеновых коньюгатов / А.Б. Косухин, Б.С. Ахметова // Лаб. дело. – 1987. – № 5. – С. 335–337.

14. Asaoka K. An enzymatic assay ofreduced glutathione using glutathione-S-aryltransferase with O-dinitrobenzene as a substrate / K. Asaoka, K. Takashi // J. Biochem. – 1981. – Vol. 90, № 5. – P. 1237–1242.

15. Gaitonde M.K., A spectrophotometric method for direct determination of cysteine, in the presence of other naturally occuring aminoaside // M.K. Gaitonde // Biochem. J. – 1967. – Vol. 104, № 2. – P. 627–633.

16. Георгиев Г.П. Информационная и рибосомальная рибонуклеиновые кислоты хромосомно-ядрышкового аппарата, методы разделения и нуклеиновый состав / Г.П. Георгиев, В.П. Мантьева // Биохимия. – 1962. – Т. 27. – С. 949–957.

17. Gill D.M. An improved method for isolation of rat liver nuclei by density centrifugation / D.M. Gill // J. Cell. Biology. – 1965. – Vol. 24. – P. 157–161.

18. Jong E.V. Father fractionaring of histones from calf thymus / E.V. Jong, A.V. Butter // Biochemical Journal. – 1962. – Vol. 82, № 1. – P.15–18.

19. Збарский Б.И. Новые данные по функционированию клеточных ядер печени крыс и химическому составу ядерных структур / Б.И. Збарский, Г.П. Георгиев // Биохимия. – 1959. – Т.24, Вып. 2. – С. 192–199.

20. Асатиани В.С. Биохимическая фотометрия / В.С. Асатиани. – М.: Издательство Академии наук СССР, 1957. – 838 с.

21. Покровский А.А. Методы разделения и ферментативной идентификации субклеточных фракций / А.А. Покровский, А.И. Арчаков // Современные методы в биохимии. – М.: Медицина, 1968. – С. 5–59.