Аспетов ДР., Омарова М.Н.,  Оракбай Л.Ж., Жуматова Б.Х

 Научный центр гигиены и эпидемиологии им. Х.Жуматова

 

ВЛИЯНИЕ  ПЕСТИЦИДА МЕТСУЛЬФУРОНМЕТИЛА НА ИНТЕРФЕРОНОБРАЗУЮЩУЮ ФУНКЦИЮ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

 

В настоящее время пестициды относятся  к одним из ведущих  экзогенных загрязнителей биосферы.  Несмотря на дозовые ограничения в  применении, при попадании  остаточных количеств пестицидов в воду, почву, а также, учитывая  способность  продуктов  их разложения  к кумуляции в окружающей среде, они представляют  определенную  угрозу  для  здоровья  человека [1,2,3 ]. Для населения, не связанного с  производством  пестицидов,  их потенциальная опасность  заключается,  главным образом,  в  употреблении  продуктов питания животного и растительного происхождения из агропромышленного  производства. Широко применяемые в последние годы  пестициды – гербициды нового поколения,  используемые  для уничтожения сорных растений и кустарников,   обладают  ярко выраженным  энзимопатическим эффектом  на ферменты  растительных клеток [4,5]. Он заключается в  инактивации  главных клеточных ферментов, отвечающих за рост  и развитие  сорных растений. Отличительной особенностью новых гербицидов метсульфуронметила и глифосата  является нечувствительность к ним генетически-модифицированных культур. Что касается изучения механизма действия пестицидов на клетки животного происхождения,  известно их токсическое действие на активность важнейших клеточных ферментов животных, например, ацетилхолинэстеразы [6,7,8]. В то же время действие пестицидов на факторы иммунной системы, в частности,  на систему интерферона еще недостаточно изучено.

В задачу исследований входило изучение действия пестицида нового поколения метсульфуронметила   на  функциональную  способность клеток человека RD к продукции  защитного  фактора иммунитета - α/β- интерферона.

Материалы и методы. 

Пестицид. Использован пестицид  метсульфуронметил (МСМ).- новыйпестицид гербицидного действия (0,600 WG.2012-02-21 Polgar agrochem.Ltd.Herbicide; Monitor WG). Применяли растворы  МСМ, приготовленные, ex tempore, из сухих гранул на основе физиологического раствора.

Клетки. В работе использовали  перевиваемую линию клеток человека RD.  Для   выращивания клеток использовали пластиковые флаконы емкостью  25см3  и  96-луночные пластиковые планшеты фирмы «BD Falcon» в среде 199 с 10% фетальной сывороткой с посевной дозой со 2х105 кл/мл. летки выращивали  в термостате при температуре 37°С,  в атмосфере, содержащей 5% СО2.

Вирусы. В качестве индуктора интерферона использовали  – вирус  болезни  Ньюкасла  (ВБН). В качестве индикаторного тест- вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей ЭМК  в рабочей дозе  100 ТЦД50/мл  (тканевых цитопатогенных доз).

Интерферон. Определяли микрометодом в 96-луночных пластиковых панелях За единицу активности интерферона МЕ/мл  принимали дозу,  обратную его максимальному разведению,  защищающему 50% клеток от цитопатогенного действия (ЦПД50) вируса энцефаломиокардита мышей (ЭМК).  В качестве контроля использовали референс препарат ИФН для перевода полученной активности в международные единицы (МЕ) [ 9,10 ].

Статистическую обработку данных проводили с применением программы  Statistica.  Различия считали достоверными при отличии от контрольных значений на величину p< 0,05  [ 11  ].

Результаты 

Определение цитотоксических свойств пестицида   метсульфурон-метила

( МСМ).

Минимальную  концентрацию МСМ, не вызывающую 50% цитодеструкции  клеток  (ЦД50)в течение 48 часов, определяли микрометодом  в монослое  клеток  RD. В 96-планшетах выращивали суточный монослой, в который вносили последовательные концентрации МСМ, начиная от 1:500 -0,5 мг (50 мкг/мл) до 1:32000. В контрольные клетки вносили питательную среду, без  МСМ. За состоянием монослоя наблюдали в течение 72 часов. Через 12 часов контакта  МСМ в концентрациях  1: 500 и 1: 1000  в клетках наблюдали дегенеративные изменения в виде округления клеток, изменения рН среды в щелочную сторону, при отсутствии цитодеструкции в контроле. За этот же период клетки в разведении 1:2000 монослой сохранялся на 50%. В клетках, дегенерации клеток  после 48 час  контакта с МСМ в разведениях от 1:4000 и далее до1: 32000 в течение 48 часов не наблюдалось. В дальнейшем,  для изучения  способности клеток к продукции интерферона использовали среднюю концентрацию МСМ 0,05 мг/мл.

Изучение  влияния времени контакта МСМ с клетками человека на продукцию – α/β интерферона.

На сформировавшийся монослой клеток, выращенных   в 96 луночных пластиковых панелях вносили по 0,05 мг/мл  МСМ в среде 199 с 10%  фетальной сывороткой  и помещали  в термостат при  t 37°С в СО2 -камере  на 24, 48, 72, 96 и 120 час, после чего  среду, содержащую МСМ, удаляли.

В монослой вносили  вирус-индуктор интерферона-  ВБН, клетки помещали в термостат  t  37°С на 24 часа, после чего культуральную среду собирали, подвергали  соответствующей обработке и использовали для определения активности α/β-интерферона.

Количество интерферона определяли по его активности в подавлении цитопатогенного действия (ЦПД50) тест вируса энцефаломиокардита мышей. Результаты определения  активности интерферона, представленные  на Рисунке 1, показали, что уровень  активности α/β-интерферона  снижался  мере увеличения времени контакта  клеток с МСМ – от  62±14,3 -  через 24 часа контакта до 12±1,5 МЕ/мл через 96 часов  экспозиции клеток с МСМ.  Контрольные клетки, не подвергшиеся воздействию МСМ за тот же период наблюдения продуцировали  ИФН с активностью  от 260±2,3 до – 112,5  ±14,2 ед/мл). Клетки  RD, обработанные МСМ  через 120 часов,  полностью утратили способность продуцировать интерферон.

По оси абсцисс – время контакта клеток с пестицидом метсульфуронметилом  - линия 2

По оси ординат – активность интерферона - линия 1

 

Рисунок  1  Продукция интерферона после контакта клеток RD с пестицидом метсульфуронметилом

   

Влияние токсического действия низких доз новых пестицидов на факторы иммунитета мало изучено. Нами показано действие пестицида нового поколения – метсульфуронметила,  широко применяемого в с/хозяйственном производстве,  на выработку главного защитного  фактора иммунитета организма  против инфекций – интерферона.

Результаты представленных  исследований показали, что пестицид метсульфуронметил  оказывал ингибирующее влияние на продукцию α/β-интерферона перевиваемыми клетками RD в концентрации, не вызывающей цитотоксического действия.  Подавление продукции интерферона  происхо- дит происходило параллельно с увеличением времени контакта  пестицида и с клетками.

                                                                 

Литература

 

1. Хамитова Р.Я., Имамов А.А. Медико-экологические  аспекты химизации сельского хозяйства . – Казань, 2006.

2. Домшлак М.Г., Макарова-Землянская Е.Н. // Медицина труда и промышленная экология – 2009. -№ 1. – С.45- 48.

3.Панина Н.К. Лабораторный контроль за остаточным количеством пестицидов в окружающей среде // Гигиена и санитария. -2010. -№ 3. – С 77-80. 

4. Лохин К.Б. Гигиеническое обоснование регламентов безопасного применения гербицидов нового поколения на основе пестицида метсульфуронметила // Дисс. …канд.мед.наук. М. 2007).

5. Dianzani F. The Interferon system. Health Sciences Press.- 1993. – 435- 439.

6.Аширбеков  Г.К., Сарсенбаева Ж.К., Ажиханова Г.Ж.  Комбинированное действие различных классов пестицидов на организм // Актуальные вопросы формирования здорового образа жизни.-2009.- №4. – С.175-176;  

7. Байзолданов Т., Даулетбакова Ф,Д., Байзолданова Ш.Т. Токсикологическое  значение пестицидов. Вестник Казахского Национального медицинского униаерситета. -  2002. - № 2 (16). – С.152-156;

8. Гущин Н.Б., Хайдарова Д.С., Кугушева Л.И. и др.  Активность ацетилхолинэстеразы лимфоцитов крыс при интоксикации  пестицидам // Бюллетень экспериментальной биологии  и медицины. – 1991. – Т. 111, № 2. – С.144 -146).    

9. Ершов Ф.И., Сайиткулов А.М. Микрометод для изучения индукторов интерферона in vitro // Вопросы вирусологии. – 1984. –Том 29. - № 6 –С.756- 757).

10. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. – М.:1996; 

11.  Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. – М.,2006.