Акимбаева А.К., к.б.н., ассистент, Кухар Е.В., к.в.н., доцент

Казахский агротехнический университет им. С.Сейфуллина

г. Астана, Республика Казахстан

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ МКА ПРИ ВЫЯВЛЕНИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ РУБРОМИКОЗА

В Казахстане из-за нарушения экологического равновесия, некорректного применения антибиотиков и других лекарственных препаратов широкое распространение среди населения получили дерматомикозы различной локализации. В экологически неблагополучных районах Казахстана отмечается все более расширяющийся спектр микромицетов – возбудителей заболеваний различной локализации за счет «факультативных паразитов», «сапрофитов», «фитопаразитов» и др., что объясняется как их изменчивостью под влиянием антропогенного воздействия, так и снижением иммунитета у населения [1].

Руброфитии, связанные с поражением ногтей (онихомикозы), распространены среди всех групп населения, особенно среди пожилых людей старше 60 лет. Но в последнее время увеличивается заболеваемость грибковыми инфекциями у детей [2].

Установлено, что наиболее распространенными являются микозы, вызванные дерматофитами рода Trichophyton rubrum (50,2%). Кроме того выявлено большое разнообразие клинической картины дерматомикозов, вызываемых T. rubrum [3].

Диагностические препараты для установления дерматомикозов в Казахстане отсутствуют, микологические исследования проводятся в течение длительного периода времени. При этом, достоверность положительных результатов при выделении чистой культуры достигает 36% [3, 4].

Целью наших исследований явилось сравнение диагностической ценности разработанной нами иммуноферментной тест-системы с регламентированными методами диагностики дерматомикозов, применяемыми в повседневной лабораторной микологической практике.

Материалы и методы

В работе использовали антиген дерматомицета T. rubrum, полученный по методу L. Tabatabai (1979) [5].

При постановке реакции агглютинации (РА), непрямого и «сэндвич» варианта ИФА в качестве положительного контроля использовали сыворотку больного К., 1941 г. р. с диагнозом «микоз стоп и онихомикоз ногтевой пластинки большого пальца левой стопы», подтвержденный культуральной диагностикой, с титром антител в непрямом ИФА – 1:6400 и в РМА – 1:256.

В качестве отрицательного контроля использовали пул сывороток здоровых людей с отсутствием специфических антител к возбудителю рубромикоза, протестированных ранее в РМА, непрямом и «сэндвич» варианте ИФА. Для контроля явления самоагглютинации применяли забуференный физиологический раствор при рН 7,2.

Результаты работы

При создании иммуноферментной тест-системы были отработаны параметры постановки реакции, включающие определение оптимальной концентрации, объёма, температуры и времени инкубации используемых реагентов. В ходе исследований установлено, что принципиальной разницы между продолжительностью сенсибилизации антигена не существует. При инкубации планшета в течение 2 часов при температуре 37° С и в течение 16-18 часов при температуре 4-5° С получены практически аналогичные результаты: 1,604 ± 0,39 и 1,528 ± 0,84, соответственно.

При подборе оптимальной концентрации антигена в лунки 96-луночного планшета его вносили в концентрации 5, 10, 15, 20, 25, 30 мкг/мл.

В ходе работы установлено, что оптимальной является концентрация антигена 10 мкг/мл, т.к. это позволяет выявлять титры антител у людей и лабораторных животных до 1:12800 с показателем ОП до 1,200-2,102. Подобные показатели выявлены и при использовании антигена в концентрациях 15-30 мкг/мл с той лишь разницей, что при употреблении антигена в концентрации 30 мкг/мл показатель ОП увеличивается до 2,848. Следовательно, использование антигена в концентрации 10 мкг/мл позволяет учитывать реакцию в среднестатистических параметрах, а увеличение концентрации антигена является нерациональным, т.к. увеличивается расход компонентов реакции при тех же показателях (таблица 1).

Таблица 1 – Расчет оптимальной концентрации антигена

при n = 3

Концентрация антигена	Показатели выявленных титров антител в сыворотках крови иммунизированных мышей			М± m
	1	2	3
5 мкг/мл	1:3200	1:800	1:3200	1:2 400	±	0,68
10 мкг/мл	1:12800	1:25600	1:25600	1:21333	±	0,34
15 мкг/мл	1:3200	1:1600	1:12800	1:5870	±	1,02
20 мкг/мл	1:12800	1:6400	1:12800	1:10667	±	0,34
25 мкг/мл	1:1600	1:25600	1:12800	1:13333	±	1,37
30 мкг/мл	1:12800	1:12800	1:25600	1:17067	±	0,34

Оптимальное разведение МКА для постановки сэндвич варианта ИФА с целью выявления специфических антител определяли следующим образом: в лунки 96-луночного планшета вносили по 50 мкл белкового антигена T. rubrum. После инкубации антигена и 1% БСА вносили МКА в разведении с 1:100 до 1:6400. После инкубации в течение 1 часа при 37° С вносили конъюгат. Антитела против структурных белков дерматомицета определяли количественно по расщеплению субстрата на спектрофотометре. В результате установлено, что наименьшее разведение МКА для постановки ИФА – 1:1600 ± 0,67, оптимальное разведение МКА – 1:400.

Для определения титра антител против возбудителя рубромикоза в сыворотках крови людей нами отрабатывался сэндвич вариант ИФА на основе МКА, который ставили на планшете (рисунок 1).

На рисунке отмечены следующие обозначения:

- МКА к белковому антигену гриба T. rubrum, иммобилизированные на твердой фазе

- несвязавшиеся вещества исследуемой сыворотки

- белковый антиген

- антивидовой конъюгат

- специфическое антитело исследуемой сыворотки

Рисунок 1 – Схема постановки ИФА для диагностики рубромикоза

Анализ сывороток крови пациентов на предмет выявления антител к возбудителю рубромикоза проводили методом иммуноферментного анализа (непрямой и сэндвич-вариант с использованием моноклональных антител (МКА) штамма гибридомы Mab/Тr 1 – 3С10 к белковому антигену Trichophyton rubrum) и реакцией агглютинации в микроварианте (РМА) с корпускулярным антигеном T. rubrum. Сыворотки крови тестировались на наличие специфических антител в трехкратном повторе.

Контроль результатов иммуноферментного анализа проводили проведением микроскопии, выделением чистой культуры и постановкой реакции агглютинации в микроварианте (РМА).

Согласно результатам клинического обследования больных специалистами-дерматологами у группы обследованных выявлены хорошо отграниченные очаги поражения округлой и овальной очертаний в паховой области и внутренней части бёдер. Периферическая зона окружена гиперемированным бордюром из мелких узелков, пузырьков и корочек. Поставлены диагнозы: трихофития гладкой кожи, паховая трихофития и рубромикоз.

При микроскопическом исследовании во всех пробах обнаружен мицелий гриба. При культуральном исследовании во всех пробах рост дерматомицетов не наблюдали в течение всего периода наблюдения (30 дней).

Для выявления специфических антител к возбудителю руброфитии проводили отбор крови в вакутейнеры, сыворотку исследовали в РМА и ИФА. Результаты анализа клинической картины заболевания, лабораторных исследований патматериала и серологического тестирования сывороток крови пациентов в сравнительном аспекте на предмет выявления возбудителя рубромикоза или антител к нему отражены в таблице 2.

Таблица 2 – Сравнительные результаты клинических и лабораторных исследований при диагностике рубромикоза

№ п/п	Клиническое исследование	Микроскопия	Культуральное исследование	РМА	непрямой вариант ИФА	«сэндвич» вариант ИФА
1	Трихофития гладкой кожи	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	РО	1:3200	1:200
2	Рубромикоз	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	1:4	1:12800	1:3200
3	Рубромикоз	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	РО	1:1600	РО
4	Трихофития гладкой кожи	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	1:2	1:3200	1:400
5	Паховая трихофития	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	1:2	1:1600	1:400
6	Трихофития гладкой кожи	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	1:2	1:1600	1:100
7	Рубромикоз	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	РО	1:6400	1:800
8	Паховая трихофития	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	РО	1:3200	1:400
9	Трихофития гладкой кожи	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	1:8	1:12800	1:3200
10	Паховая трихофития	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	РО	1:6400	1:400
11	Рубромикоз	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	РО	1:1600	1:400
12	Рубромикоз	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	1:256	1:3200	1:12800
13	Глубокая трихофития гладкой кожи	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	1:8	1:800	1:6400
14	Рубромикоз	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	1:16	1:800	1:3200
15	Рубромикоз	Обнаружен мицелий гриба	роста нет	1:4	1:3200	1:800

Примечание: РО – реакция отрицательная.

Как видно из таблицы 2, по результатам клинических диагностических исследований из 15 исследованных 7 проб (47%) были определены как положительные на рубромикоз. Микроскопия позволила выявить мицелий в пробах материала в 15 пробах (100%), однако возбудитель не идентифицирован до вида и рода. При бактериологическом исследовании рост дерматомицетов отсутствовал. Это объясняется тем, что (со слов врачей и самих пациентов) все обследованные до обращения за специализированной медицинской помощью самостоятельно лечились фунгицидными препаратами или, при назначении препаратов специалистами частных медицинских центров, принимали противопаразитарную терапию парентерально и наружно, что и отразилось впоследствии на результатах культуральных исследований.

При тестировании сывороток крови пациентов в непрямом варианте ИФА, «сэндвич» варианте ИФА с использованием МКА и РМА выявлено положительных: в РМА – 4 пробы, в непрямом варианте ИФА – 15, и в «сэндвич» варианте ИФА – 12 проб.

В РМА положительных проб было выявлено 15%, что говорит о низкой специфичности данной реакции. В непрямом варианте ИФА все исследуемые пробы показали положительный результат (100%). Недостаточную специфичность непрямого варианта ИФА может объяснить тот факт, что в исследуемых пробах сывороток присутствуют антитела к близкородственному виду дерматомицета, так как дерматофиты содержат в своем составе несколько полисахаридных компонентов, общих для всех грибов, а также имеют большое количество группо- и родоспецифических антигенов.

При использовании МКА, полученных к одной детерминанте антигена Т. rubrum, в ИФА выявлено 80% положительных результатов.

Совпадение положительных результатов в «сэндвич» варианте ИФА и при клиническом обследовании обнаружено в 6 образцах проб, но в ИФА выявлено положительных результатов в два раза больше. Объясняется это тем, что характерные клинические признаки проявляются только при генерализованной или хронической форме течения болезни. В ИФА антитела к возбудителю заболевания улавливаются уже на начальных этапах заражения.

Считаем, что в пробах №9 и №13 также следует уточнять диагноз, т.к. здесь возможны врачебные ошибки. Результаты иммуноферментного анализа с применением тест-системы на основе моноклональных антител, которая является высокоспецифичной, свидетельствуют о процессе, вызванном Т. rubrum. Этот вывод подтверждают также результаты реакции агглютинации и непрямого варианта ИФА.

Результаты исследований позволяют установить диагностический титр для разработанного нами сэндвич-варианта иммуноферментного анализа.

Учитывая особенности строения клеточной стенки дерматомицетов и наличие слабо выраженных перекрестных реакций, титр антител 1:400 считать свидетельствующим о возможном заражении Т. rubrum или родственными видами дерматомицетов и принимать за сомнительный результат. При выявлении титра антител 1:400 и ниже, рекомендуем наблюдение за данными показателями в динамике через 14 – 28 суток и повторное выделение чистой культуры. Титр антител к возбудителю руброфитии равный 1:800, считаем диагностическим, который указывает на явное заражение Т. rubrum. Титр антител 1:100 и ниже не учитывать как положительный результат и принимать за показатели фона.

Во всех случаях при получении слабоположительных результатов 1:200-1:400 рекомендуем проведение культуральной диагностики и тщательный анализ результатов на наличие оппортунистической микрофлоры.

Таким образом, нами отработаны параметры ИФА с использованием МКА для выявления антигенов в патматериале и специфических антител в сыворотке крови людей к Т. rubrum. Специфические антитела к Т. rubrum выявляются в сыворотке крови при её разведении до 1:12800, антигены дерматомицета выявляются в патматериале с помощью непрямого варианта ИФА (качественная реакция) и в сэндвич варианте ИФА.

Полученные данные свидетельствуют о возможности использования МКА штамма гибридомы Mab/Тr 1 – 3С10 в качестве реагента при разработке иммуноферментных тест-систем, которые позволят значительно усовершенствовать методы лабораторной диагностики дерматомикозов человека, вызванных Т. rubrum.

Использованная литература

1 Фадеева Л.М., Бызова З.М., Айдарханова Г.С. Микроскопические грибы и их реакция на изменяющиеся экологические условия // Ядерно-физические методы и их возможности применения в биологии и агроэкологии. – Алматы, 1999. – С. 56-57.

2 Карибаева А.Т. Клинико-эпидемиологические особенности дерматомикоза, обусловленного Тriсhорhуtоn violaceum // Проблемы медицинской микологии. – 2008. – Т. 10, №2. – С. 68.

3 Pierard G. Onychomycosis and other superficial fungal infections of the foot in the elderly a pan-European survey // Dermatology. – 2001. – Р. 202, 220-224.

4 Умбетьярова Л.Б. Детская проблема г. Алматы. // Успехи медицинской микологии. – 2004. – № 4. – С. 21-22.

5 Сұраншиев Ж.Ә. Brucella-ның сыртқы мембрана белоктарын сиыр бруцеллезін балауда қолдану. Вет. ғыл. кан. ... авторефераты. – Астана, 2003. –25 б.