аспірант Гринчук К.В.

к.с.г.н. Антіпов І.О.

Національний університет біоресурсів і природокористування України

РОЗРОБКА СИСТЕМ ПЛР АНАЛІЗУ ГЕНОМУ ВІРУСУ НЕКРОТИЧНОГО ПОЖОВТІННЯ ЖИЛОК БУРЯКУ

 

Вірус некротичного пожовтіння жилок буряку (ВНПЖБ) є збудником хвороби ризоманії, яка уражує цукрові, кормові та столові буряки. Вперше вірус був зафіксований в 1959 році на Півночі Італії, на сьогоднішній день розповсюджений у всьому світі, де вирощуються цукрові буряки. Відноситься до роду Benyvirus, який включає в себе віруси, що передаються плазмодіафоровим грибом Polуmуxa betae [1, 3]. Геном ВНПЖБ мультипартидний – представлений чотирма сегментами одноланцюгової (+) РНК. Деякі ізоляти представлені п`ятьма cегментами РНК . РНК-1 довжиною 6746 нуклеотидів, кодує протеїн P237, (молекулярна маса 237 кДа), відповідає за реплікацію вірусного геному [2]. РНК-2 (4612 н.) кодує білок оболонки вірусу – Р19 та протеїн Р75, який містить KTER мотив, необхідний для передачі вірусу вектором. Гени Р42, Р13, Р15, необхідні для руху вірусу в рослині та ген Р14, пригнічує захисні функції рослинного організму при ураженні вірусною інфекцією, також знаходяться на РНК-2. РНК 3 (1175 н.) кодує протеїн Р25, містить гени, які провокують розвиток симптомів на рослинах Chenopodium quinoa у випадку штучного ураження рослин. Протеїн Р25 (молекулярна маса 25 кДа), який розташований на РНК 3, важливий для формування симптомів ураження на коренеплоді. РНК 4 (1431 н.) кодує протеїн Р31, необхідний для передачі вірусу грибом Polуmуxa betae, також виконує функцію супресора замовчування генів [4]. РНК 5 кодує протеїн масою 26 кДа (Р26). На території Франції, Казахстану, Японії, Англії зустрічається ВНПЖБ з п`ятьма сегментами РНК. ВНПЖБ з РНК-5 більш вірулентний і уражує рослини, які стійкі до вірусу [6].

 

Після механічної інокуляцї лабораторних рослин РНК 3, РНК 4, РНК 5 можуть частково або повністю руйнуватися. Взалежності від наявності чи відсутності певних РНК симптоми вірусного ураження відрізняються: при РНК 1+2+3+4 формуються симптоми у вигляді жовтих плям; RNA 1+2+4 –хлоротичні плями та хлоротичні кільця; RNA 1+2 – некротичні плями, за наявності РНК 4 або РНК 5 відмічають формує сильніший хлороз [5, 8].

Об`єктом дослідження був український ізолят вірусу некротичного пожовтіння жилок буряку, який попередньо було ідентифіковано в Чемеровецькому районі Хмельницької області.

         Для проведення біоінформативного аналізу використовували нуклеотидні послідовності, що кодують гени: Р237, Р75, Р25, Р31, Р26. Проаналізовано у системі даних генетичних послідовностей нуклеотидні послідовності відомих ізолятів. Показані консервативні ділянки, що кодують геном вірусу некротичного пожовтіння жилок буряку. Використовуючи консервативні нуклеотидні послідовності генів, за допомогою програмного забезпечення «Primer3», нами створено дизайн праймерів з оптимальними параметрами: GC-склад 40-60 %, відсутність неспецифічних вторинних структур (шпилек, димерів), близькі температури відпалу пари праймерів

Реакційна суміш для проведення ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), об’ємом 15 мкл містила: 1х ПЛР буфер (Amplisens) з 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ дезоксинуклеозидтрифосфатів (дНТФ) (Amplisens), 1 пкмоль кожного з олігонуклеотидних праймерів, 40 нг матричної ДНК, 0,5 U Taq полімерази (Amplisens).

ПЛР проводили за наступних умов: початкова денатурація 5 хв. при 940С; тридцять циклів:денатурація 30 с. при температурі 94 0С, відпал праймерів 30 с. при 60 0С, елонгація 30 с. при 72 0С, заключний синтез 72 0С 7 хв. Ампліфікацію визначених геномних послідовностей проводили в ДНК-ампліфікаторі «Терцик».

         Після ампліфікації продукти ПЛР розділяли горизонтальним електрофорезом у 1,5 %-му агарозному гелі, який готували, використовуючи ТBE буфер з концентрацією 0,5 мг/мл броміду етидію. Результати ПЛР візуалізували УФ променями трансілюмінатора.

Розроблено системи аналізу геному вірусу некротичного пожовтіння жилок буряку. Встановлено, що на території України циркулює ізолят, який містить 4 сегменти РНК: РНК 1, РНК 2, РНК 3, РНК 4. РНК 5 в геномі вірусу некротичного пожовтіння жилок буряку відсутня.

 

ЛІТЕРАТУРА

1.       Abe H.. Studies on the ecology and control of Polymyxa betae Keskin as a fungal vector of the causal virus (Beet necrotic yellow vein virus) of Rhizomania disease of sugar beet. Rep. No. 60: Р. 80-99. – 1987.

2.       Bouzoubaa, S., Quillet, L., Guilley, H.. Jonard. G. & Richards. K.. Nucleotide sequence of beet necrotic yellow vein virus RNA-1. J. Gen. Virol 68: Р 615-626. –1987.

3.       Canova, A.. Appunti di patologia della barbabietola. Inf. Fitopatol. 20: Р.390-396. –1959.

4.       Dunoyer, P.. Pfeffer. S., Fritsch. C. Hemmer, O., Voinnet, O. & Richards, K. E.. Identification, subcellular localization and some properties of a cysteine-rich suppressor of gene silencing encoded by Peanut clump virus. Plant J. 29: Р. 555-567. – 2002.

5.       Koenig, R. & Burgermeister. W.. Mechanical inoculation of sugarbeet roots with isolates of beet necrotic yellow vein virus having different RNA compositions. J. Phylopalhol.124: Р. 249-255. – 1989.

6.       Miyanishi, M., Kusume, T., Saito, M. & Tamada. T. Evidence for three groups of sequence variants of Beet necrotic yellow vein virus RNA 5. Arch. Virol. 144: Р.879-892. – 1999.

7.       TAMADA, T. & ABE. H.. Evidence that beet necrotic yellow vein virus RNA-4 is essential for efficient transmission by the fungus Polymyxa betae. J. gen. Virol. 70:3391-3398. – 1989.

8.       Virus Taxonomy: The Classification and Nomenclature of Viruses / [Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., Desselberger U., Ball L.A.]; In: C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff, U. Desselberger, L.A. Ball. – [The Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses (book)]. – San Diego, CA. USA.: Elsevier Academic Press. – P.1162. – 2005.