Біологічні науки. Мікробіологія

студент Пащенко К.А., доцент, к.б.н. Волошина О.С.

Національний університет харчових технологій, Україна

Використання генномодифікованого штаму E. coli для утилізації технічного гліцерину

Виробництво біодизельного палива є перспективним шляхом забезпечення все зростаючого попиту на альтернативні джерела енергії. За статистикою в Сполучених Штатах річний обсяг виробництва біодизелю в 2012 році (3,15 млн. тон) був 2,83 рази вище, ніж у 2010 році (1,11 млн. тон), до 2022 року використання біопалива планують збільшити до 0,11 млрд. тон [1].

Відомо, що при виробництві біодизельного палива гліцерин є побічним продуктом. Зростання обсягу виробництва біодизельного палива збільшує і кількість побічного продукту. На кожні 10 кг біодизелю припадає приблизно
1 кг неочищеного гліцерину, що в рік, наприклад для країн Європи, складає більше 60 тис. т. В останні кілька років, ціна на технічний гліцерин зменшилась з 0,44 $ до 0,11 $ за кілограм [2]. Зростання обсягу виробництва біопалива відповідно збільшує і кількість побічного продукту і, в даний час, багато підприємств змушені нести витрати за зберігання утвореного гліцерину [3].

Надлишок гліцерину потрапляє в навколишнє середовище, стає причиною його забруднення, що може стати екологічною проблемо. Тому в даний час ведуться інтенсивні пошуки способів переробки технічного гліцерину в більш цінні продукти.

Вже на сьогодні спектр речовин, одержуваних мікробною конверсією гліцерину досить широкий. Одним з основних продуктів є 1,3-пропандіол, що застосовується як пластифікатор смол, пластичних мас і плівок. Вироби з цих речовин знаходяться в контакті з харчовими продуктами, застосовуються для змащування і консервації пакувальних машин в харчовій, фармацевтичній та косметичній промисловості [4].

1,3-пропандіол, в основному, одержують шляхом хімічного синтезу. Обсяг виробництва складає близько 100 тис. т. на рік. Недоліками даного способу є низька селективність, енергоємність, висока вартість виробництва та негативний вплив на навколишнє середовище. Економічно вигідним процесом виробництва 1,3-пропандіолу є бактеріальна ферментація. Компанія Genencor Corporation (США) створила промисловий спосіб отримання 1,3-пропандіолу з використанням рекомбінантного штаму Escherichia coli [5].

В роботі вчених Біотехнологічного науково-дослідного інституту, Шанхайської академії сільськогосподарських наук, описано новий поліцистронний оперон для поліпшення промислового виробництва
1,3-пропандіолу [6]. Було обрано чутливий до температури вектор pBV220, який проводить експресію генів від промотора фага λ P_LP_R до клітини при температурі 42 °С. Промотор регулюється репресором cIts857, який був експресований в E. coli К-12 ER2925, що кодує термочутливе регулювання білку. Були використані гени, що відповідають за синтез 1,3-пропандіолу в Clostridium butyricum, dhaB₁ – кодує вітамін В₁₂-незалежну гліцериндегідратазу, dhaB₂ – кодує активаторний фактор для вітаміну B₁₂-незалежну гліцериндегідратазу та yqhD – кодує ізофермен оксидоредуктазу, НАДФ-залежної дегідрогенази, що отримали від дикого штаму E. сoli. Ці гени були експресовані в E. colі К-12 ER2925 з використанням двох несумісних плазмід (pET28a і pET22b) у присутності селективного тиску.

Перевагами використання E. colі К-12 ER2925 є те, що даний штам не патогенний для людини, на відміну від деяких природних мікроорганізмів, що продукують 1,3-пропандіол. Також, він має високу швидкість росту, що може зменшити час бродіння.

Мікробний синтез 1,3-пропандіолу з гліцерину з використанням рекомбінантного штаму E. coli був вивчений в процесі двоступеневої ферментації. На першому етапі було одержано збільшення біомаси. Основні метаболіти – органічні кислоти, головним чином ацетат.

На другому етапі, гліцерин швидко перетворювався на 1,3-пропандіол при зміні температури від 30 °С до 42 °С. Побічними продуктами були в основному піруват і ацетат. Під час даного двоступеневого процесу ефективність виробництва досягла 104,4 г/л, вихід 1,3-пропандіолу з використанням гліцерину в якості єдиного джерела вуглецю становив 2,61 г/л за годину, швидкість перетворення гліцерину в 1,3-пропандіол досягла 90,2 % (г/г), а загальний час бродіння – всього 40 годин.

Порівняно з показниками анаеробної ферментації гліцерину концентрація 1,3-пропандіолу була значно нижчою – 70,4 г/л для Clostridium butyricum,
70-78 г/л для Klebsiella pneumoniae [7]. Продуктивність і рівень конверсії гліцерину в 1,3-пропандіолу в цих системах були менше, ніж 1,57 г/л на годину і менше 75% (г/г) відповідно [8].

Отже, створення рекомбінантного штаму E. coli К-12 ER2925 робить вагомий внесок в переробку технічного гліцерину, в 1,3-пропандіол і допоможе зменшити витрати на утилізацію відходів виробництва біодизелю. Це не тільки важливо з економічної точки зору, але і для покращення стану навколишнього середовища.

Література:

1. А.с. 2404248, МКИ С 12 Р 7/18. Способ производства 1,3-пропандиола с использованием сырого глицерина / Лиу Хоньджуан, Сан Яy, Лиин Рихуи. – Опубл. 07.12.2006

2. Yang, F.X., Hanna, M.A., Sun, R.C. Value-added uses for crude glycerol - A byproduct of biodiesel production // Biotechnology for Biofuels. – 2012. – V. 5. № 13. – Р. 5–13.

3. Дирина Е.Н., Винаров А.Ю. Проблемы и перспективы разработки биотехнологии утилизации отходов производства биодизеля из растительного сырья // Сельскохозяйственная биология. – 2008. – № 3. – С. 24–32.

4. Дымент О.Н., Казанский К.С. Гликоли и другие производные окисей этилена и пропилена. – М.: Химия, 2000. – 376 с.

5. Pat. 6514733 USА. Process for the biological production of 1,3-propanediol with high tite / Emptage, M., Haynie, S. L., Laffend, L. – Publ. 4.02.2003.

6. Nakamura C.E., Whited G.M. Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol // Curr. Opin. Biotechnol. – 2003. – V. 3.
№ 14. – Р. 454–459.

7. Liu H.J., Zhang D.J., Sun Y.Q. Microbial production of 1,3-propanediol from glycerol by Klebsiella pneumoniae under micro-aerobic conditions up to a pilot scale // Biotechnol. Lett. – 2007. – V. 29. – P. 1281–1285.

8. Nakamura C.E., Whited G.M. Metabolic engineering for the microbial production of 1,3-propanediol // Curr. Opin. Biotechnol. – 2003. – № 14. – Р. 454–459.