Микробиология

К.б.н. Лахтин М.В., д.м.н. проф. Афанасьев С.С., д.б.н. Лахтин В.М.,

д.б.н. проф. Алешкин В.А.

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

НОВЫЕ ГЛИКОКОНЪЮГАТЫ-РАСПОЗНАЮЩИЕ СИСТЕМЫ В КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ЖИДКОСТЯХ  ПЕРСПЕКТИВНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ  ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ЛАКТОБАЦИЛЛ

      Резюме

      С помощью хемилюминесцентного и флюоресцентного анализов идентифицированы визуальные паттерновые новые белковые гликоконъюгаты-связывающие/чувствительные/распознающие/различающие системы культуральных жидкостей перспективных пробиотических штаммов бифидобактерий и лактобацилл. Лектиновые и гликоконъюгатные системы взаимодействовали мозаичным образом по принципам: один лектин – ограниченный ранжированный набор гликоконъюгатов, один гликоконъюгат – ограниченный ранжированный набор лектинов, система лектинов – система гликоконъюгатов. Лектиновые системы различали синтетические полимерные универсальные антигены медицинского применения.

      Ключевые слова: бифидобактерии, лактобациллы, типирование, культуральная жидкость, белки, лектины, гликоконъюгаты, антигены, пробиотики, человек.

      Resume

      Lakhtin M.V., Afanasiev S.S., Lakhtin V.M., Aleshkin V.A. G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology & Microbiology, Russia. New glycoconjugates-recognizing systems in cultural fluids of perspective probiotic strains of bifidobacteria and lactobacilli.

     New protein glycoconjugates-binding/sensitive/recognizing/discriminating visual pattern systems of cultural fluids of perspective probiotic strains of bifidobacteria and lactobacilli were identified using chemiluminescent and fluorescent analyses. Lectin and glycoconjugate systems interacted in mosaic manner according to principles: one lectin – limited ranged panel of glycoconjugates, one glycoconjugate – limited ranged panel of lectins, lectin system – system of glycoconjugates. Lectin systems discriminated artificial polymeric universal antigens of medical significance.

      Key words: bifidobacteria, lactobacilli, typing, cultural fluid, proteins, lectins, glycoconjugates, antigens, probiotics, human.

      Введение: Лектины относятся к гликоконъюгаты(ГК)-связывающим белкам неиммуноглобулиновой природы. Они являются важными регуляторами метаболизма, причем лектины бифидобактерий и лактобацилл (ЛБ и ЛЛ) человека имитируют действие пробиотиков, в том числе проявляют синергистические антимикробные эффекты и кофункционируют с защитными системами организма человека [1-3]. В связи с этим актуальным является поиск новых источников новых системных лектинов пробиотических бактерий (ЛПБ). Цель – исследовать в качестве источников новых ЛПБ расширенный набор перспективных пробиотических бифидобактерий и лактобацилл с использованием расширенного набора стандартных ГК.

      Материалы и методы: Исследовали B. bifidum 791, B. longum В379М , B.longum Х, B. pseudocatenulatum OV-2, B. pseudocatenulatum OV-15, Lactobacillus helveticus NK1 и L. amylovorus БТ-24/88. Штаммы - из Коллекции микроорганизмов при МИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Бактерии выращивали 18-24 ч при 37оС в казеиново-дрожжевой среде с солями (КД-5с) или обезжиренном гидролизованном молоке (ГМ) с добавками. Культуральные жидкости (КЖ) и супернатанты получены от Криворучко Е.В. и Черепановой Ю.В. Жидкую фазу деэмульсифицировали кипячением 30 мин, замораживали, полностью удаляли верхний слой сливок, размораживали. Надосадочную жидкость стерилизовали вакуумной мембранной микрофильтрацией в патроне Steriflip (Millipore) и компоненты микрофильтрата (> 27 кД) концентрировали мембранной ультрафильтрацией в патроне Centricon Plus-20 (Millipore). Белок в пробах контролировали спектрофотометрическим методом Waddel в нашей модификации [4]. Концентраты разделяли по методу Lasne [5] высоковольтным изоэлектрофокусированием в пластине полиакриламидного геля в области линейного градиента рН 2-6 в присутствии мочевины и сахарозы при 10оС, компоненты электроблотировали на мембранный сэндвич, включающий гидрофильную мембрану – Durapore (Millipore) и гидрофобную мембрану Immobillon Р (Millipore). Для блокировки и промывок блотов использовали 0.005%-Tween в фосфатно-солевом буфере рН 7.4 (ФСБ). После обработки блотов уксуснокислым водным раствором метанола белки проявляли флюоресцентным красителем на основе рутения (метод-1) - SYPRO Ruby Blot Protein Stain (www.probes.com/syprodyes). Возбуждали флюоресценцию красителя при 254 нм (для получения набора полос с повышенной интенсивностью флюоресценции) или при 365 нм (для типирования штаммов). Среди выявленных белков методом-1 далее идентифицировали ГК-связывающие белки методом-2 [2]. Использовали набор биотинилированных ГК на основе линейной цепи полиакриламида с боковыми множественными ответвлениями коротких цепей с моно- или дисахаридными остатками (www.lectinity.com). Блоты до или после обработки кислым раствором метанола (последний вариант -  наиболее результативный) обрабатывали ГК-биотином (1 мкг/мл; в ФСБ, инкубация в течение ночи при 4оС при перемешивании) и стрептавидин-пероксидазой, добавляли хемилюминесцентный субстрат пероксидазы с повышенной чувствительностью - BioWest (Pierce, США). Хемилюминесценцию и флюоресценцию регистрировали в режиме живого изображения в камере EPI Chemi Dark Room II системы BioChemi System (UVP, Calif.) в виде серии кинетических картин с использованием фильтра Ethydium Bromide. Картины анализировали с помощью программного обеспечения Labworks4.

      Использовали следующие ГК (псевдополисахариды, антигены, пептидогликан; в скобках синонимы):

*Fuc-альфа1-   [псевдо(альфа-L-фукан)],

*Galбета1-    [псевдо(бета-D-галактан)],

*GaNAc-альфа1-   [поли(Tn-антиген)-содержащий полимер],

*GalNAc-альфа1,3Gal-бета1-   [Adi; поли(AII-группы крови-антиген)-содержащий полимер],

*GalNAc-альфа1,3GalNAc-бета1- [Fs; поли(антиген Форсмана)-содержащий полимер],

*GalNAc-альфа1,3GalNAc-альфа1- ,

*Gal-альфа1,3GalNAc-альфа1-   [поли(Tαα-антиген)-содержащий полимер],

*GalNAc-бета1- [десиалированный псевдомуцин],

*Gal-бета1,4GlcNAc-бета1-   [поли(LacNAc)-содержащий псевдомуцин],

*Man-альфа1-    [псевдо(альфа-D-маннан)],

*(MurNAc-L-Ala-D-isoGln)β1-   [MDP-; поли(мурамилдипептид)-содержащий полимер; псевдопептидогликан],

*Rha-альфа1-   [псевдо(альфа-L-рамнан)].

     Результаты и их обсуждение:

     На рис. 1-А показаны штамм-зависимые белковые наборы, выявленные методом-1. При проявлении белков набором ГК различия между штаммами, видами и родами грамположительных бактерий усиливались (рис. 1-Б). На примере лактобацилл (штамм NK1) видно, что рост в КД-5с приводит к образованию более выраженных наборов белков и лектинов по сравнению с ростом в ГМ (рис. 1).

      Выявлены мажорные формы ЛЛ штамма NK1 со специфичностью к псевдоманнану (Man-альфа-) в области изоэлектрических точек (рI) 4.6-4.8, псевдомуцину (GalNAc-бета-) с pI около 4.2 в области 4.0-4.4 (слабее чем у бифидобактерий), псевдофукану ( L-Fuc-альфа-) с pI в области 4.0-4.4, псевдопептидогликану (мурамилдипептид-), полимерному А-дисахариду (Adi) (имитация поверхности эритроцитов А(II)-группы крови человека). Практически отсутствовало связывание ЛЛ и ЛБ с ГК с дисахаридными остатками Gal-альфа1,3-GalNAc-альфа-, а также с псевдорамнаном (L-Rha-альфа-). Выявлены мажорные формы ЛБ B.longum со специфичностью к псевдоманнану (Man-альфа-) с рI в области 4.5-4.6, псевдомуцину (GalNAc-бета-) с pI в интервале 4.0-4.2 , псевдофукану ( L-Fuc-альфа-) с pI в области 4.0-4.4 (отличается связывание ЛБ от ЛЛ штамма NK1 изоточками положения полос, распределением доминант выраженности связывания; ЛБ отражают родовые признаки тестированных бифидобактерий, отличающиеся от ЛЛ-признаков тестированных лактобацилл). Картины связывания псевдополисахаридов, антигенов А(II)-группы крови и Форсмана (встречается в эритроцитах), псевдопептидогликана (имитирующего бактериальный пептидогликан) зависели от принадлежности бактерий к роду, виду, штамму. Обнаружено сходство лектиновых систем, специфичных к ГК с экспонированными остатками N-ацетил-галактозамина (GalNAc-бета-; A-дисахаридом; GalNAc-альфа-GalNac-бета-).Кроме того, сходство в области массива белка с рI 4.5-5.0 обнаруживалось у систем лектинов, специфичных к псевдоманнану или псевдопептидогликану.

      Альфа-L-фукан-связывающие ЛПБ (рI 3.7-4.3; блок 2-3полос ближе к 3.8-3.9) у лактобацилл были выражены сильнее и протяженнее по сравнению с бифидобактериями. Наблюдалось отсутствие лектинов этого типа у штамма OV-15. До обработки блота кислым раствором метанола область рI 4.0-4.4 в случае бифидобактерий была маскирована (одна полоса при рI 3.9 у B.bifidum 791). При этом выявлялись дополнительные две менее выраженные области: рI 3.6-3.7 (у штамма NK1, нет у штамма БТ-24/88) и 4.8-4.9 (сильнее у лактобацилл, чем у бифидобактерий).

      Наблюдалось отсутствие связывания поли(Gal-альфа-1,3-GalNAc-альфа-) с белками L.helveticus, L.amylovorus и B.longum. Отсутствовало также связывание поли(альфа-L-Rha-) c обработанным кислым метанолом блотом.

      Выявлялись другие индивидуальные качественные и количественные особенности лектиновых систем исследованных штаммов лактобацилл и бифидобактерий (рис. 1).

      Результаты указывают на послойное расположение лектинов, участие ЛПБ в направленных надмолекулярных сборках, способствующих кофункционированию ЛПБ с другими белками, в том числе в вариантах ЛПБ-организованной доставки эффекторов из раствора на твердую фазу.

      Лектиновые системы в белковом массиве одного и того же штамма располагались мозаичным образом (наблюдались мажорные и минорные формы ЛПБ), а сам характер мозаики зависел от типа ГК (рис. 1-Б). Есть основания полагать, что присутствие нескольких подобранных пробиотических штаммов позволит расширить спектр ЛПБ, сориентированных на выбранную/заданную мишень (ГК). Это может быть одним из принципов конструирования пробиотического консорциума пробиотических штаммов.

      Из рис. 1-Б также видно, что один и тот же лектин (или группа близко локализованных сблоченных лектиновых форм) пробиотических бактерий может узнавать в большей или меньшей степени (узнавать ранжированно) набор (систему) ГК разных типов. Таким образом, предложенный в работе подход и полученные результаты указывают на перспективы системных исследований ЛПБ, когда одному лектину (одному ГК) противопоставлена ранжированная система ГК (ЛПБ), а мозаике ЛПБ противопоставлена адекватная мозаика ГК, что и имеет место в микробиоценозах биотопов человека. Ключевым примером являются представленные на рис. 1-Б результаты различения системами ЛПБ синтетических муцинового типа полимерных поливалентных GalNAc-содержащих антигенов медицинского значения.

      Заключение: Результаты указывают на перспективы использования систем ГК (или ЛПБ) для выявления новых систем ЛПБ (или ГК) с потенциальными новыми биологическими активностями; прогнозирования и использования адгезивных, антигены-узнающих, противоопухолевых и других биологических свойств штаммов и их метаболитов, типирования грамположительных бактерий, выбора штаммов и их комбинаций при конструировании синбиотиков и пробиотических консорциумов. Предложенные блотинговые модели взаимодействий белковых и гликоконъюгатных систем являются более простыми, точными и надежными альтернативами использованию клеточных модельных систем для аналогичных целей. Выявленные мажорные формы ЛПБ, связывающие конкретные типы ГК, имеют перспективы препаративного получения и использования.

      Литература:

1. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Алешкин А.В. Лектины и ферменты в биологии и медицине. Москва: Издательство «Династия», 2010. 496 с. ISBN 978-5-98125-076-7.

2. Lakhtin M., Lakhtin V., Aleshkin A., Bajrakova A., Afanasiev S., Aleshkin V. Lectin systems imitating probiotics: potential for biotechnology and medical microbiology. In: “Probiotics 2012”, Edited by E.C. Rigobelo. 2012. P. 417 – 432. ISBN 978-953-51-0776-7. http://dx.doi.org/10/5772/3444.

3. Lakhtin M., Aleshkin V., Lakhtin V., Afanasiev S., Pozhalostina L., Pospelova V. Probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium lectins against Candida albicans and Staphylococcus aureus clinical strains: New class of pathogen biofilm destructors. Probiotics & Antimicrobial Proteins. 2010. V. 2. P. 186 - 196.

4. Лахтин В.М., Лахтин М.В., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Комплексная оценка белка в супернатантах грамположительных бактерий. Клиническая лабораторная диагностика. 2010. № 9. С. 37. ISSN 0869-2084.

5. Lasne F. Double blotting: a solution of the problem of non-specific binding of secondary antibodies in immunoblotting procedures. J. Immunol. Meth. 2001. V. 253. P. 125-131.

 

рН5

 рН 4

А   1      2      3      4     5      6      7      8           1      2      3      4     5      6      7      8

       

Б            2     3      4     5          1    2     3    4     5     6      1      2       3     5     6     7

 

Рис. 1. Белки КЖ пробиотических бактерий, разделенные в интервале рН 4-5. А. Белки, определенные методом-1 (справа- контуры всего белкового массива). Б. ГК-связывающие белки, идентифицированные методом-2 с использованием ГК (слева-направо): Adi (2-5), GalNAc (1-6), Fs (1-7). Штаммы: 1- L.helveticus NK1 (КД-5c ), 2- L.helveticus NK1 (ГМ), 3- L.amylovorus БТ24/88 (ГМ), 4- B.longum Х (ГМ), 5- B.longum B379M (ГМ), 6- B.bifidum 791 (ГМ), 7- B.pseudocatenulatum OV-2 (ГМ), 8- B.angulatum OV-15 (ГМ).