Микробиология

К.б.н. Лахтин М.В., д.м.н. проф. Афанасьев С.С., д.б.н. Лахтин В.М.,

д.б.н. проф. Алешкин В.А.

Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

ПРОТЕОМ ПРОИЗВОДСТВЕННОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО

ШТАММА BIFIDOBACTERIUM LONGUM MC-42 ЧЕЛОВЕКА

Резюме

С помощью флюоресцентного красителя выявлено не менее 29 сблоченных групп преимущественно кислых белков (более 27 кД) культуральной жидкости B. longum MC-42 в интервале pI 4-8. Катионные формы составляли более 21%.

Ключевые слова: бифидобактерии, культуральная жидкость, белки.

Resume

Lakhtin M.V., Afanasiev S.S., Lakhtin V.M., Aleshkin V.A. G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology & Microbiology, Russia. Proteome of cultural fluid of industrial probiotic strain B. longum MC-42 of human origin. At least 29 groups of mainly acidic proteins (> 27kD) within pI 4-8 were identified using fluorescent dye. Cationic forms were represented by more than 21% of total forms.

Key words: human probiotic bifidobacteria, cultural fluid, proteins.

Введение: Среди пробиотических бифидобактерий и лактобацилл человеческой природы B. longum MC-42 характеризуется как выраженный продуцент штамм-специфичных системных белков, которые в сочетании с белками других пробиотических штаммов обладают синергистическим антимикробным действием [1, 2]. В связи с этим важным является первичное исследование полного белкового набора бифидобактерий. Цель – оценить протеом культуральной жидкости (КЖ) бифидобактерий на примере производственного пробиотического штамма B. longum MC-42.

Материалы и методы: Штамм B. longum MC-42 - из Коллекции микроорганизмов при ФБУН «МИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора. Бактерии выращивали 18-24 ч при 37 ^оС в Бифидум-среде

(п. Оболенск, Московская обл.). Получали концентраты (> 27 кД) микрофильтрацией супернатанта через Millipore) с последующей ультрафильтрацией через Centricon Plus-20 (Millipore). Белок определяли методом Waddel в нашей модификации [3]. Концентраты разделяли изоэлектрофокусированием (650-700 В, ночь, 10^оС) в пластине полиакриламидного геля в градиенте рН 4-8 в присутствии мочевины, компоненты электропереносили на гидрофобную мембрану Immobillon Р (Millipore) [4]. Белки проявляли флюоресцентным красителем SYPRO Ruby Blot Protein Stain (Bio-Rad) при возбуждении флюоресценции при 254 нм. Флюоресценцию регистрировали в режиме живого изображения в камере EPI Chemi Dark Room II системы BioChemi System (UVP, Calif.) с использованием фильтра Coomassi или Ethydium Bromide. Минорные белковые серии выявляли с помощью программного обеспечения Labworks4.

Результаты и их обсуждение:

Использование фильтров Coomassi и Ethydium Bromide давало взаимодополняющие результаты (рис. 1). Выявлялись не менее 29 сблоченных групп преимущественно кислых белков (более 27 кД) КЖ B. longum MC-42 в интервале pI 4-8, в том числе серии минорных сильнокислых и околонейтральных белков (возбуждение при 365 нм давало менее четкую дискретность наборов). Катионные формы белков превышали 21%. Белки маскировались экзополимерными соединениями при pI > 7.7. Мажорные белки характеризуются выраженностью хромофоров (Trp, Tyr, других).

Заключение: Предложенный подход к типированию протеома КЖ бифидобактерий перспективен для дальнейшего анализа белковых функций.

Литература:

1. Лахтин М.В., Алешкин В.А., Лахтин В.М., Несвижский Ю.В., Афанасьев С.С., Поспелова В.В. Роль лектинов пробиотических микроорганизмов в жизнеобеспечении макроорганизма // Вестник Российской академии медицинских наук. 2010. № 2. С. 3 - 8. ISSN 0869-6047.

2. Lakhtin M., Aleshkin V., Lakhtin V., Afanasiev S., Pozhalostina L., Pospelova V. Probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium lectins against Candida albicans and Staphylococcus aureus clinical strains: New class of pathogen biofilm destructors. Probiotics & Antimicrobial Proteins. 2010. V. 2. P. 186 - 196.

3. Лахтин В.М., Лахтин М.В., Черепанова Ю.В., Поспелова В.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Комплексная оценка белка в супернатантах грамположительных бактерий // Клиническая лабораторная диагностика. 2010. № 9. С. 37. ISSN 0869-2084.

4. Лахтин В.М., Лахтин М.В., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Электрофоретические паттерны экзополисахаридов в типировании грамположительных бактерий (на примере штаммов пробиотических бифидобактерий) // Клиническая лабораторная диагностика. 2013. № 9. C. 76.

5. Лахтин М.В., Афанасьев С.С., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Караулов А.В., Несвижский Ю.В., Афанасьев М.С., Алёшкин А.В., Воропаева Е.А., Слободенюк В.В. Структурно-функциональные ассоциаты экзополимеров пробиотических бифидобактерий и лактобацилл // Естественные науки. 2013. № 4.

рН 1 2 3 4 рН

Рис. 1. Белки КЖ B. longum MC-42. Фильтр Coomassi (треки 1 и 2) или Ethydium Bromide (треки 3 и 4). В треках 2 и 3 показаны минорные белки треков 1 и 4. Белки 27-29 маскированы экзополимерами [5].