Національний
університет харчових технологій, Україна
Альтернативні
шляхи отримання інтерферону
Інтерферони (ІФН) – це група біологічно
активних білків або глікопротеїдів, які синтезуються клітиною у процесі
захисної реакції на чужорідні агенти – вірусну інфекцію, антигенний та
мітогенний вплив. Вони продукуються і містяться в усіх ядровмісних клітинах і
епітеліальних клітинах слизових оболонок. На сьогоднішній день ІНФ є одними із сучасних засобів
терапії та профілактики вірусних захворювань. Широко використовуються ці
препарати і у вірусологічних дослідженнях. Сьогодні застосування інтерферонів у
медичній та дослідницькій практиці є звичайним.
У 1957 р. вірусологи - співробітники
Лондонського національного інституту англієць Айзекс і швейцарець Ліндеман
випадково під час дослідів відкрили інтерферон.
Перші трансгенні рослини (рослини тютюну
з вбудованими генами з мікроорганізмів) були отримані в 1983 р. Перші успішні
польові випробування трансгенних рослин (стійкі до вірусної інфекції рослини
тютюну) були проведені в США вже в 1986 р.
Після проходження всіх необхідних тестів
на токсичність, алергенність, мутагенність і т.д. перші трансгенні продукти
з'явилися у продажу в США в 1994 р. Це були томати Flavr Savr з уповільненим дозріванням, створені фірмою
"Calgen", а також гербіцид - стійка соя компанії "Monsanto"
. Вже через 1-2 роки біотехнологічні фірми поставили на ринок цілий ряд
генетично змінених рослин: томатів, кукурудзи, картоплі, тютюну, сої, ріпаку [1], кабачків,
редису, бавовнику.
В даний час отриманням і випробуванням
генетично модифікованих рослин займаються сотні комерційних фірм у всьому світі
з сукупним капіталом понад сто мільярдів доларів. У 1999 р. трансгенні рослини
були висаджені на загальній площі близько 40 млн. га, що перевищує розміри
такої країни, як Великобританія. У США генетично модифіковані рослини (GM
Crops) складають зараз близько 50 % посівів кукурудзи та сої і більше 30-40 %
посівів бавовнику. Це говорить про те, що генно - інженерна біотехнологія
рослин вже стала важливою галуззю виробництва продовольства та інших корисних
продуктів, яка залучає значні людські ресурси та фінансові потоки. Перша хвиля
трансгенних рослин, допущених для практичного застосування, містила додаткові
гени стійкості (до хвороб, гербіцидів, шкідників, псування при зберіганні,
стресів).
Нинішній етап розвитку генетичної
інженерії рослин отримав завдання не стільки поліпшити ті чи інші наявні якості
рослини, як при традиційній селекції, скільки навчити рослина виробляти
абсолютно нові з'єднання, використовувані в медицині, хімічному виробництві та
інших областях. Цими сполуками можуть бути, наприклад, особливі жирні кислоти,
корисні білки з високим вмістом незамінних амінокислот , модифіковані
полісахариди, їстівні вакцини, антитіла, інтерферони та інші
"лікарські" білки, нові полімери, що не засмічують навколишнє
середовище і багато, багато іншого. Використання трансгенних рослин дозволяє
налагодити масштабне і дешеве виробництво таких речовин і тим самим зробити їх
більш доступними для широкого вжитку [2].
Для виробництва рекомбінантних
інтерферонів використовуються різні системи, включаючи бактеріальні і дріжджові
[3] клітини. Рослини як джерело фармацевтично
цінних білків мають ряд важливих переваг, а саме можливість отримання
рекомбінантних білків з необхідними пострансляційними модифікаціями, що не
забруднених бактеріальними токсинами або патогенами тварин і людини, такими як
віруси і пріони [4]. У деяких випадках рекомбінантні
білки рослинного походження можна використовувати без очищення як їстівних
вакцин, що значно знижує їх собівартість. Фізіологічно активні інтерферони
людини були отримані в рослинах тютюну, салату [5], моркви [6] і суспензійних
клітинних культурах рису [8].
Людський ІНФ α2 в моркві продемонстрував високу активність ІНФ в листі до
50.7 * 103 МО/г, а в корені було зафіксовано понад 6,5 * 103
МО/г [7]. Введення чужорідного гена в геном хлоропластів
дозволяє у багатьох випадках значно підвищити рівень його експресії.
Трансмодифіковані рослини тютюну накопичували до 3 мг інтерферону 2 b людини на
г біомаси (20 % сумарного розчинного білка) [7]. Однак
генетична трансформація хлоропластів є складним завданням, для багатьох
господарсько - цінних видів рослин вона на сьогоднішній день не вирішена.
Альтернативним способом збільшення кількості рекомбінантного білка може бути
транзієнтної (тимчасова) експресія відповідного гена в рослинах [7]. Таким методом
були отримані фізіологічно активні інтерферони людини і інтерферон птахів.
Салат, що накопичує інтерферон курей, було запропоновано використовувати як
добавку до раціону домашньої птиці для профілактики вірусних захворювань [8]. До недоліків
транзієнтної експресії слід віднести складність проведення цього процесу у
великих масштабах, в той час як стабільно трансформовані рослини легко
культивувати у великих масштабах. Основним недоліком рослин зі стабільно
трансформованим ядерним геномом є низький рівень експресії чужорідного гена,
недостатній для економічно вигідного процесу виробництва цільового білка. Однак
висока питома активність інтерферону 2b дозволяє отримувати рослини, що
демонструють противірусну дію, навіть при стабільній інтеграції відповідного
гена в ядерний геном. Якщо за основу взято вид рослин, придатний для вживання в
сирому вигляді, можна не проводити очищення цільового білка, використовуючи
рослинну біомасу як добавку до раціону тварин.
Відомо, що перенесення гена
інтерферону людини в геном рослининий може призводити до підвищення їх
стійкості до фітовірусів. Прикладом може бути визначення стійкості до вірусу
тютюнової мозаїки (ВТМ) трансгенних рослин цикорію Сichorium intybus var foliosum Hegi сорти Пала Росса з геном
ІНФ людини. Також розробленні методи для трансформації генів людського
інтерферону α2 в рослину алое вера. Були надані дані про те що алое вера
здатна експресувати білок людини [9].
Було проведено дослідження,
для якого використовували рослини, які були трансформовані за допомогою А. rhizogenes і А. tumefaciens з векторами рСВ161 і рСВ124 ( гени : селективний і
NptII цільової інф -2b , промотори Mll і 35S відповідно). Отримані рослини
культивувались на агаризованому середовищі Мурасиге і Скуга при 24 oС
і 16 - годинному фотоперіоді. Раніше методом ПЛР було підтверджено присутність
гена інф -2b в геномі отриманих рослин, а також була показана противірусна
активність екстрактов трансгенних рослин по відношенню до вірусу везикулярного
стоматиту (ВВС) у клітинах нирок бика (лінія MDBK).
В результаті було показано,
що рослини цикорію з геном ІНФ людини не виявляли стійкості до ВТМ інфекції.
Ряд ліній рослин не тільки не були стійкими , але і характеризувалися розвитком
вірусної інфекції з високим накопиченням вірусу (0,8-1 оптичних одиниць ) в
порівнянні з позитивним контролем (0,3). Однак, трансформовані рослини
синтезували біологічно активний інтерферон, а їх екстракти виявляли
противірусну активність на клітинах MDBK. Таким чином, трансгенні рослини
цикорію з геном ІНФ людини виявилися чутливі до ВТМ. Можливо, відсутність
стійкості викликано синтезом неспецифічного для рослини білкового продукту і,
як наслідок, підвищенням чутливості до ВТМ [10].
Підсумовуючи, можна зробити
висновки про те, що широкий спектр біологічної активності системи інтерферону
обумовлює її важливу контрольно-регуляторну роль у збереженні організму. Також
важливо відмітити і те, що у зв’язку із поширенням патогенів вірусної природи,
такі препарати як інтерферони користуються все більшим попитом. Загалом
необхідно відмітити, що пошук і створення нових трасгенних рослиних з геном
інтерферону і надалі буде достатньо актуальним.
Литература:
1.
Гочева Є.А., Сахно Л.О., Кучук
М.В. Спосіб отримання трансформованих рослин ріпаку методом агробактеріальної
трансформації // Патент України на корисну модель № 39205. – Публ. 10.02.2009,
бюл. № 3.
2.
Gerasymenko I. M., Sakhno L. O., Mazur M. G, Sheludko Y. V. Multiplex PCR assay for detection of human interferon alpha2b gene in
transgenic plants // Cytology and genetics. – 2012. – Vol. 46. – P.197-201.
3.
Ghosalkar A., Sahai V., Srivastava A. Secretory
expression of interferon-alpha 2b in recombinant Pichia pastoris using
three different secretion signals // Protein Expression and Purification -
2008. - Vol. 60. - P. 103-109.
4.
Daniell H., Streatfield S.J., Wycoff K. Medical molecular farming: production of
antibodies, biopharmaceuticals and edible vaccines in plants // Trends in Plant
Sci. – 2001. – Vol. 6. – P. 219–226.
5.
Matvieieva N. A.,. Shakhovskij A. M. Features
of lettuce transgenic plants with the ifn-α2b gene regenerated after
Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation // Cytology and
genetics. – 2012. – Vol. 46. – P. 150-154.
6.
Luchakivskaya Yu., Kishchenk О., Gerasymenko І., Olevinskaya Z., Spivak М. High-level expression of human interferon alpha-2b in transgenic carrot
(Daucus carota L.) plants // Transgenic Reserch. – 2011. –
Vol. 30. – P. 407-415.
7.
Arlen P.A., Falconer R., et al. Field production
and functional evaluation of chloroplast-derived interferon-alpha2b // Plant
Biotechnol J. - 2007. – Vol. 5. – P. 511-525.
8.
Song L., Zhao D.G., et al.Transient expression of chicken alpha interferon gene
in lettuce // J Zhejiang Univ Sci B - 2008. - Vol.9. - P.351-355.
9.
William
Lowther,Kevin Lorick,Susan D.
Lawrence,Wen-Shuz Yeow. Expression of
biologically active human interferon alpha 2 in Aloe vera // Transgenic Reserch. – 2012. – Vol. 21. – P. 1349-1357.
10.
Matvieieva N. A, Kudryavets Yu. I, Likhova A. A, Shakhovskij A. M, Bezdenezhnykh N. A., Kvasko E. Yu. Antiviral activity of
extracts of transgenic chicory and lettuce plants with the human interferon α2b gene // Cytology and genetics. – 2012. – Vol. 46. – P. 285-290.