Кучеренко В.П., Жуков В.І., Максимова І.Г.

Харківський національний медичний університет (м. Харків)

ДОСЛІДЖЕННЯ МЕМБРАНОТРОПНИХ ЕФЕКТІВ ПРИ СУБТОКСИЧНІЙ ДІЇ НА ЩУРІВ ПРОСТОГО ОЛІГОЕФІРУ –ПОЛІОКСИПРОПІЛЕНГЛІКОЛЮ МОЛЕКУЛЯРНОЇ МАСИ 2100

Вступ

Процеси розпаду й синтезу складних біоорганічних речовин обумовлюють стабільність лабільних структур організму, необхідних для підтримки гомеостазу, провідним фактором в якому виступає метаболізм. Чисельні шляхи метаболізму тісно поєднані між собою й лежать в основі всіх найважливіших функцій організму [1]. Повноцінне функціонування метаболічних процесів тісно поєднано з діяльністю фізіологічних і біохімічних систем, що забезпечують гомеостаз. На думку багатьох авторів, передпатологічні й патологічні стани проявляються функціональною або структурною дисфункцією мембрано-структурованих метаболічних систем і надмолекулярних рецепторних комплексів [1, 2]. Останнім часом змінюються первинні уявлення про порушення нормального функціонування ферментних систем під впливом хімічних агентів, як пускового механізму дисбалансу гомеостазу. Все більш широке розповсюдження отримують дослідження про провідну роль рецепторного апарату плазматичних мембран у регуляції процесів життєдіяльності за фізіологічних умов і при шкідливих екологічних впливах. При цьому особливо підкреслюється значення цитоплазматичних мембран та їх рецепторів, як активних регуляторів внутрішньоклітинного метаболізму через систему вторинних посередників, що сприймають і передають у клітину сигнали. Зміни й порушення структурних компонентів мембран під впливом токсичних факторів, особливо фосфоліпідів і білків, можуть служити сигналом для вторинних посередників про необхідність функціональної перебудови клітини. Що стосується фосфоліпідів, то це пов’язано з уявленням про них, як регуляторів активності мембранозв’язаних ліпід-залежних ферментів [1, 2].

Серед причин порушення структури й функції мембран при дії токсичних речовин важливе місце займає активація вільнорадикальних процесів і перекисного окислення ліпідів (ПОЛ), що призводить до дезоорганізації мембранних систем, модифікації клітинних білків і розвитку ряду патологічних станів [2, 3]. У зв’язку з тісною єдністю структури, функції й метаболізму, пошук критеріально-значущих показників передпатологічних станів організму слід проводити, перш за все, вивчаючи структурно-функціональний стан клітинних мембран і механізми регуляції життєдіяльності органів-мішеней [2, 3]. Порушення внутрішньоклітинного метаболізму тісно поєднані з фізико-хімічним станом мембран, які в кооперативній взаємодії забезпечують перебіг анаболічних і катаболічних процесів. Зміна структури біологічних мембран і розвиток деструктивних процесів спостерігаються при багатьох захворюваннях серцево-судинної системи, хірургічних втручаннях, алергічних реакціях, порушеннях нейроендокринної регуляції обміну речовин, імунологічній недостатності й інших патологічних станах, у тому числі пов’язаних з дією на організм фізичних, хімічних, емоціогенних і біологічних факторів [1, 2]. На сьогодні накопичилося достатньо багато даних щодо здатності хімічних сполук стимулювати в організмі вільнорадикальні процеси й ПОЛ, які супроводжуються підвищенням у тканинах та органах вмісту перекисів, гідроперекисів, вільних радикалів з мембранотропною дією [1-3]. Тому вивчення структурно-функціонального стану клітинних мембран під впливом антропогенних хімічних факторів є прогностичною основою при донозологічній оцінці передпатологічних станів, що є актуальною медико-біологічною проблемою.

Метою роботи було вивчення структурно-функціонального стану мембран в умовах тривалого підгострого впливу на організм щурів простого поліефіру - поліоксипропіленгліколю молекулярної маси 2100 у дозах 1/10, 1/100, 1/1000 і 1/10000 ДЛ₅₀.

Матеріали та методи дослідження. Вибір простого поліефіру (ПОЕ) технічної марки «Лапроли» (Лп) - поліоксипропіленгліколю молекулярної маси 2100 (ПОЕ-Лп-2102), обґрунтовано широким використанням у народному господарстві та необхідністю складання прогнозу потенційної небезпеки для теплокровних тварин. Враховуючи фізико-хімічні властивості ПОЕ-Лп-2102, зокрема поверхнево-активну дію, можна допустити його вплив на білкові й ліпідні компоненти клітинних мембран в умовах субтоксичної тривалої токсифікації. Програма дослідження передбачала вивчення мембранних фракцій фосфоліпідів, іонної проникності мембран, їх в’язкості, заряду, полярності, плинності, активності вільнорадикальних процесів, ПОЛ і окислювальної модифікації білків відповідно до загальноприйнятих методик [3-6]. Згідно літературних джерел, інтенсивність індукованої перекисом водню хемілюмінесценції (ХЛ) віддзеркалює утворення найбільш реакційноздатних радикалів (ОН^•-гідроксильного, О₂^•-супероксидного аніон-радикалу кисню), з якими взаємодіють біологічні субстрати – білки, ліпіди, нуклеїнові кислоти й ін. [4]. Вони ініціюють ланцюговий процес ПОЛ у клітинних мембранах, а також ліпопротеїнах крові. На думку багатьох авторів, накопичення активних форм кисню, перекисів, гідроперекисів і вільних радикалів активує розвиток мембранної патології й підвищує швидкість старіння організму [4-6]. Підгострий експеримент було проведено на білих статевозрілих щурах популяції Вістар, яким щоденно вранці натщесерце внутрішньошлунково за допомогою металевого зонда вводили розчини ПОЕ-Лп-2102 із розрахунку 1/10, 1/100, 1/1000 і 1/10000 ДЛ₅₀. На основі параметрів гострої токсичності ПОЕ-Лп-2102 відноситься до помірно токсичних сполук. Його ДЛ₅₀ була встановлена на рівнях 1,45 г/кг маси тварин [7, 8]. Тривалість експерименту складала 60 діб при дотриманні принципів біоетики. У кожній експериментальній групі було по 10 тварин. Статистичне опрацювання отриманих результатів здійснювалося з використанням методів варіаційної статистики по Стьюденту-Фішеру.

Результати дослідження та їх обговорення. Дослідження вільнорадикальних процесів і ПОЛ виявило зростання на 30-ту добу токсифікації тварин інтенсивності спонтанної ХЛ (СХЛ), індукованої FeCl₃ ХЛ (FeCl₃-ІХЛ), а також люмінол-залежної, індукованої FeCl₃ ХЛ (ЛЗ FeCl₃-ІХЛ) під впливом 1/10, 1/100 і 1/1000 ДЛ₅₀. У 1/10000 ДЛ₅₀ ПОЕ-Лп-2102 не впливав на показники ХЛ сироватки крові (табл. 1).

Таблиця 1

Вплив ПОЕ-Лп-2102 на динаміку інтенсивності хемілюмінесценції сироватки крові в умовах тривалої субтоксичної дії (І^о-імп/с)

Показник, термін	Група спостереження, М±m (ЛД50)
	Контроль ( n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)	1/10000 (n=10)
30 доба СХЛ FeCl3-ІХЛ ЛЗ FeCl3-ІХЛ	134,3±9,5	348,4±16,2*	260,3±18,4*	215,4±13,5*	141,7±12,5
	672,4±15,6	1873,5±24,8*	1742,6±22,7*	1427,5±16,3*	683,4±16,8
	1795,6±31,4	2463,7±33,5*	2241,5±28,9*	1832,6±21,4*	1803,5±27,6
60 доба СХЛ	152,7±11,8	114,6±7,9*	295,6±14,8*	257,4±17,5*	144,6±13,5
FeCl3-ІХЛ	683,6±16,7	617,8±11,6*	1863,7±25,8*	1485,6±20,7*	675,8±15,7
ЛЗ FeCl3-ІХЛ	1788,4±40,5	965,3±17,4*	2362,8±37,9*	1882,6±18,5*	1778,5±36,2

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Найбільш високі рівні інтенсивності СХЛ, FeCl₃-ІХЛ і ЛЗ FeCl₃-ІХЛ спостерігались у групах тварин, токсифікованих 1/10 ДЛ₅₀, а найменші – при дії 1/1000 ДЛ₅₀. На 60-ту добу експерименту виявлено зниження інтенсивності СХЛ, FeCl₃-ІХЛ і ЛЗ FeCl₃-ІХЛ, тоді як під впливом 1/100 і 1/1000 ДЛ₅₀ вона залишилася підвищеною при порівнянні з групою контроля. Результати свідчать, що ПОЕ-Лп-2102 є активатором вільнорадикальних процесів і ПОЛ. Пригнічення інтенсивності ХЛ на 60-ту добу під впливом 1/10 ДЛ₅₀ може свідчити про деструктивні процеси, що супроводжуються надходженням до сироватки крові вільних сульфгідрильних груп, які є пригнічувачами надслабкого світіння. Тому дозу 1/10 ДЛ₅₀ слід розглядати як таку, що призводить до зриву захисно-пристосувальних механізмів, поєднаних з розвитком патологічних процесів і пригніченням системи антиоксидантного захисту. Підвищення рівнів інтенсивності FeCl₃-ІХЛ і ЛЗ FeCl₃-ІХЛ підтверджує ланцюговий вільнорадикальний характер окислення в біологічних системах. В умовах токсифікації ПОЕ-Лп-2102 утворюється О₂^•-супероксидний аніон-радикал кисню й ОН^•-гідроксильний радикал, що свідчить про наявність високих рівнів збуджених електронних станів.

Система високих енергетичних рівнів триплетного положення електронів у білках була підтверджена вивченням фосфоресценції сироватки крові. Підвищення рівнів інтенсивності фосфоресценції сироватки крові (табл. 2) характеризує наявність високих рівнів триплетних збуджених станів, які супроводжуються зміною конформаційної структури білкових молекул, що може бути поєднано з їх окислювальною модифікацією [3–5]. Вивчення інтенсивності фосфоресценції сироватки крові експериментальних тварин виявило суттєві розбіжності їх рівнів при довжині хвилі збудження монохроматичним світлом 297, 313, 334, 365, 404 і 434 нм.

Таблиця 2

Вплив ПОЕ-Лп-2102 на інтенсивність фосфоресценції сироватки крові при тривалій субтоксичній дії (І^о-імп/с) на 60-ту добу експерименту

Спектр збудження (нм)	Група спостереження, M±m (ДЛ50)
	Контроль ( n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
297	4270,6±35,2	6535,8±41,5*	5392,6±38,7*	4940,3±35,8*
313	3215,4±27,3	5997,3±32,4*	4898,3±25,6*	3810,7±29,3*
334	627,8±18,5	1240,6±20,7*	1124,7±22,8*	925,4±18,9*
365	1868,4±29,4	2684,5±22,3*	2497,3±27,2*	2205,3±27,4*
404	412,3±11,7	1368,6±14,5*	1292,6±20,7*	971,5±18,6*
434	614,8±16,5	1287,2±21,3*	1159,7±18,4*	980,6±16,3*

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Особливо спостерігалося підвищення інтенсивності фосфоресценції по відношенню до контрольної групи при 404 і 434 нм. Результати показали, що інтенсивність фосфоресценції при 404 нм підвищувалася на 231,9%, 213,5% й 135,6%, а при 434 нм – на 109,36%, 88,63% й 59,49% відповідно за дії 1/10, 1/100 і 1/1000 ДЛ₅₀ у порівнянні з контрольною групою спостереження.

Відомо, що агрегація білків і втрата компактної структурно-функціональної організації призводять до суттєвого підвищення жорсткості мікрооточення триптофанових залишків і поєднано зі зростанням рівнів фосфоресценції, що супроводжується розгортанням і надбанням білками первинної структури [4–6]. Дані ХЛ і фосфоресценції свідчать, що ПОЕ-Лп-2102 в 1/10, 1/100 і 1/1000 ДЛ₅₀ стимулює вільнорадикальні процеси, ПОЛ і окислювальну модифікацію білків, які виступають важливим ланцюгом розвитку структурно-метаболічних порушень в організмі й підтверджуються зростанням у сироватці крові вмісту малонового діальдегіду (МДА), дієнових кон’югатів (ДК) і продуктів окислювальної модифікації білків – 2,4-динітрофенілальдогідразонів (2,4-ДНФАГ) (λ=370 нм) і 2,4-динітрофенілкетогідразонів (2,4-ДНФКГ) (λ=380 нм) (табл. 3). Состерігалося зростання усироватці крові рівнів МДА в 4,3 і 2,7 раза ДК – у 3,9 і 2,3 раза 2,4-ДНФАГ – у 2,9 та 1,8 раза 2,4-ДНФКГ – у 2,7 та 1,8 раза відповідно в групах щурів, токсифікованих 1/10 і1/100 ДЛ₅₀. У дозі 1/1000 ДЛ₅₀ ПОЕ-Лп-2102 не впливав на показники ПОЛ та окислювальної модифікації білків.

Таблиця 3

Вплив ПОЕ-Лп-2102 на показники ПОЛ та окислювальну модифікацію білків під впливом субтоксичних доз

Показники	Група спостереження, ДЛ50 (M±m)
	Контроль ( n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
МДА, мкмоль/л	5,76±0,53	24,82±2,10*	15,63±1,36*	5,57±0,62
ДК, мкмоль/л	19,85±1,67	77,50±4,18*	46,24±3,73*	18,46±1,54
2,4-ДНФАГ, од. опт. щільн./г білка	23,52±1,74	68,35±3,96*	44,18±2,66*	24,38±1,65
2,4-ДНФКГ, од. опт. щільн./г білка	27,35±1,86	74,82±3,85*	49,23±3,17*	28,15±2,10

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Враховуючи, що ПОЕ-Лп-2102 відноситься до неіоногенних поверхнево-активних речовин, імовірність його впливу на ліпідні компоненти мембран є дуже високою. У цьому зв’язку було проведено визначення відсоткового вмісту фракцій фосфоліпідів в еритроцитах, лейкоцитах і гепатоцитах під впливом 1/100 ДЛ₅₀. Дослідження виявили суттєві порушення динаміки відсоткового вмісту фракцій фосфоліпідів у мембранах еротроцитів, лейкоцитів і гепатоцитів. У всіх випадках дія ПОЕ-Лп-2102 супроводжувалася зниженням фосфатидилетаноламіну (ФЕА), сфінгомієліну (СМ), фосфатидилінозитолу (ФІ), фосфатидилсерину (ФС) і підвищенням рівня фосфатидилхоліну (ФХ), лізофосфатидилетаноламіну (ЛФЕА), лізофосфатидилхоліну (ЛФХ) і кардіоліпину (КЛ) (табл. 4). Загальною й характерною ознакою виявлених змін фракцій фосфоліпідів було значне підвищення лізоформ фосфоліпідів, що підтверджувало мембранотропну дію ПОЕ-Лп-2102, яка супроводжується накопиченням високотоксичних метаболітів обміну ліпідів. Найбільш виразними спостерігалися порушення в еритроцитах, що пов’язано, ймовірно, з низьким рівнем репаративних і синтетичних процесів у мембранах цих клітин.

Таблиця 4

Вплив ПОЕ-Лп-2102 в 1/100 ДЛ₅₀ на фосфоліпідний склад еритроцитів, лейкоцитів і гепатоцитів щурів при тривалій токсифікації (%)

Показник	Контрольна група (M±m), n=10			Дослідна група (M±m), n=10
	еритро-цити	лейко-цити	гепато-цити	еритро-цити	лейко- цити	гепато-цити
ФЕА	21,3±1,53	24,5±1,83	23,62±1,75	14,4±0,96*	15,3±1,27*	16,4±1,45*
ФХ	41,3±1,72	38,6±1,61	38,7±1,42	57,8±2,53*	59,8±3,34*	60,7±2,73*
СМ	14,4±1,26	17,3±1,52	15,8±1,16	10,5±0,88*	11,3±0,82*	9,8±0,74*
ФС	11,5±0,84	9,3±0,73	9,82±0,87	7,10±0,54*	7,25±0,63*	7,12±0,63*
ЛФЕА	1,2±0,42	1,41±0,21	1,43±0,65	3,92±0,46*	3,67±0,42*	4,35±0,44*
ЛФХ	1,5±0,33	1,22±0,04	1,27±0,08	4,2 ±0,52*	4,15±0,37*	4,27±0,56*
ФІ	6,2±0,73	7,2±0,68	7,54±0,86	3,51±0,27*	3,62±0,35*	3,82±0,43*
КЛ	0,5±0,08	0,63±0,06	0,56±0,04	0,88±0,04*	0,86±0,05*	0,94±0,05*

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

По закінченню підгострого експерименту (на 60-ту добу) встановлено зниження плинності й коефіцієнта ексимеризації пірена в цитоплазматичних мембранах клітин крові порівняно з контролем. Цьому процесу в більшій мірі підлягали еритроцитарні мембрани, в яких значні зміни були виявлені в ліпідному бішарі й в зоні білок-ліпідних контактів. Залежно від дози ПОЕ-Лп-2102 плинність мембран знижувалася практично на 60% (табл. 5). У лімфоцитах зниження плинності мембран стосувалося переважно ліпідного бішару й було максимальним під впливом 1/10 ДЛ₅₀. Аналіз показав, що ПОЕ-Лп-2102 в 1/10 й 1/100 ДЛ₅₀ підвищував і занурення білків у ліпідний бішар мембран еритроцитів і лімфоцитів. У більшій мірі ці зміни стосувалися також мембран еритроцитів. Виявлені порушення структурно-функціонального стану мембран можна екстраполювати на активність мембрано-структурованих ферментів, виконуючих важливу транспортну функцію субстратів обміну іонів металів, що є значущим показником зміни внутрішньоклітинного метаболізму під впливом ПОЕ-Лп-2102.

Таблиця 5

Вплив ПОЕ-Лп-2102 на плинність мембран еритроцитів і лімфоцитів (коефіцієнт ексимеризації пірена (λ випромінювання – 470 нм/λ випромінювання – 393 нм) в умовах тривалої токсифікації на 60-ту добу

Група тварин, доза	Показник, M±m
	лімфоцити		еритроцити
	білок-ліпідні контакти	ліпідний бішар	білок-ліпідні контакти	ліпідний бішар
Контроль (n=10)	3,78±0,26	3,6±0,23	2,86±0,14	2,82±0,17
1/10 (n=10)	1,65±0,18*	1,73±0,26*	1,35±0,09*	1,48±0,06*
1/100 (n=10)	2,13±0,14*	2,20±0,19*	1,83±0,07*	1,67±0,13*
1/1000 (n=10)	3,72±0,31	3,57±0,28	2,71±0,17	2,80±0,22

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Проте слід відмітити, що ПОЕ-Лп-2102 викликав більш суттєві зміни плинності й занурення білків у ліпідний матрикс мембран еритроцитів, ніж у лімфоцитарних мембранах. Інтенсивність флуоресценції 1-аніліну-8-нафталін-сульфату (1,8-АНС-флуоресцентний зонд) у лімфоцитах та еритроцитах, що віддзеркалює зміну поверхневого заряду плазматичних мембран, суттєво знижувалася в групах дослідних тварин. Падіння рівнів флуоресценції свідчить про те, що ПОЕ-Лп-2102 здатний призводити до розвитку гіперполяризації клітинних мембран і порушенню їх фізико-хімічних властивостей. Залежно від дози ПОЕ-Лп-2102 пригнічення рівнів інтенсивності флуоресценції знаходилося в інтервалі від 35 до 95%. Дані літератури вказують, що зниження флуоресценції може бути пов’язано з підвищенням полярності мембран за рахунок дегідратації білкових молекул і накопиченням води в мембранних структурах [4, 6].

Дослідження показали, що тривала субтоксична дія ПОЕ-Лп-2102 супроводжується глибокими порушеннями фізико-хімічних властивостей мембран, у тому числі іонної проникливості. Так, в 1/10 й 1/100 ДЛ₅₀ ПОЕ-Лп-2102 підвищував самовільний та індукований валіноміцином вихід іонів К⁺ з еритроцитів порівняно з контролем (табл. 6). Встановлено, що більш інтенсивно ПОЕ-Лп-2102 впливає на самовільний вихід іонів К⁺ з еритроцитів, ніж індукований валіноміцином.

Таблиця 6

Вплив ПОЕ-Лп-2102 на самовільний та індукований валіноміцином вихід іонів К⁺ з еритроцитів (млн./хв.)

Група тварин, доза	Швидкість само-вільного виходу К^+з еритроцитів	Швидкість індуко-ваного валіноміци-ном виходу К^+	Сумарна кількість іонів К^+на 1 млн еритроцитів
Контроль	0,54±0,02	6,75±0,34	18,73±1,68
1/10 (n=10)	6,37±0,45*	17,28±1,47*	93,65±5,82*
1/100 (n=10)	5,74±0,48*	14,10±1,26*	82,46±6,17*
1/1000 (n=10)	0,53±0,035	6,68±0,44	17,82±1,57

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Таким чином, результати дослідження показали, що ПОЕ-Лп-2102 в 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ здатний стимулювати в організмі щурів вільнорадикальну патологію, ПОЛ та окислювальну модифікацію білків субтоксичному впливі призводять до розвитку молекулярної мембранної патології, що супроводжується порушеннями фізико-хімічних і метаболічних властивостей мембран: проникливості, плинності, заряду, гідрофобного об’єму, полярності, процентного вмісту фосфоліпідів, в’язкості. Такі зміни фізико-хімічних властивостей мембран призводять до порушення внутрішньоклітинного метаболізму, розвитку дистрофічних і деструктивних процесів у різних органах і тканинах. Недіюча доза обґрунтована на рівні 1/1000 ДЛ₅₀. Найбільш чутливими методами діагностики мембранної патології є визначення хемілюмінесценції та фосфоресценції.

Література

1. Губский Ю.И. Перекисное окисление мембранных липидов и его регуляция при химическом поражении печени / Ю.И. Губский // Коррекция химического поражения печени. – Киев: Здоровья, 1989. – С. 93–113.

2. Владимиров Ю.А. Чем болеют и от чего умирают клетки / Ю.А. Владимиров // Наука в СССР. – 1989. – № 2. – С. 76–81.

3. Токсиколого-гигиеническая характеристика органических смесей на основе гликолей в связи с проблемой санитарной охраны водоёмов / [А.Я. Цыганенко, Л.Г. Шаповал и др.] – Белгород, 2001. – 147 с.

4. Владимиров Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю.А. Владимиров, Г.Е. Добрецов. – Москва: Наука, 1980. – 320 с.

5. Дубинина Е.Е. Окислительная модификация белка. Методы её определения / Е.Е. Дубинина, Р.О. Бурмистрова [и др.] // Вопросы мед. химии. – 1996. – Т. 41, Вып. 1. – С. 24–26.

6. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. – Москва: Наука, 1972. – 320 с.

7. Красовский Г.Н. Среднее эффективное время гибели животных, как параметр для прогнозирования хронической токсичности веществ / Г.Н. Красовский // Гигиена и санитария. – 1982. – № 7. – С. 12–14.

8. Елизарова О.Н. Определение пороговых доз промышленных ядов при пероральном введении / Елизарова О.Н. – Москва: Медицина, 1971. – 173 с.