Аспетов Д.Р., Жуматова Б.Х., Кенжебаева А.Т.,

Оксюзов С.С., Шакетова Н.Т.

РГКП НЦ гигиены и эпидемиологии КГСЭН МЗ РК, г.Алматы

ЦСЭЭ г. Павлодар

ИЗУЧЕНИЕ ИНТЕРФЕРОНПРОДУЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ СПЛЕНОЦИТОВ МЫШИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЕСТИЦИДА ГЛИФОСАТА

Широкое использование химических средств защиты растений - пестицидов приводит к опасности загрязнения окружающей среды обитания, вследствие попадания их в атмосферу, водоемы, почву, продукты питания [1].

Известно, что с конца 80-х годов до 95% стойких в окружающей среде пестицидов попадают в организм с продуктами питания. Наибольший риск для здоровья детского населения при воздействии пестицидов приходится на заболеваемость острыми инфекциями верхних дыхательных путей [2].

Глифосат – самый распространенный системный гербицид, применяемый для борьбы с сорняками, занимает первое место в мире по производству. Является производным аминокислоты глицина. Химический состав глифосата отражен в его названии: N-фосфо-метил-глицин. Наиболее чувствительными к воздействию пестицидов оказались показатели лейкоцитарного и липидного спектров крови и иммуноглобулины А [3]. В то же время влияние глифосата на продукцию цитокинов и, в частности на выработку ключевого фактора воспаления- интерферона, необходимого для реализации защитных функций врожденного иммунного ответа, остается не изученным. Цель настоящего исследования определить степень воздействия пестицида глифосата на функцию лимфоцитов селезенки мыши (спленоцитов) в отношении продукции α - и γ – интерферонов в условиях in vitro.

Материалы и методы. Культуру спленоцитов селезенки мыши готовили в среде Игла, содержащей 8% телячьей эмбриональной сыворотки. Во избежание микстреакции на аллогенные тканевые антигены в одном опыте использовали не более 1-2 селезенок. К селезенкам, полученным в стерильных условиях, добавляли 5,0 мл. среды 199 и гомогенизировали спленоциты при помощи гомогенизатора Потера. После чего взвесь клеток сливали в стерильную пробирку и центрифугировали при 1000 об/мин. в течение 25 минут. Эритроциты лизировали путём добавления к осадку клеток 0,83% раствор NH₄CL. Лизис клеток проводили в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторным центрифугированием осаждали спленоциты, а лизат эритроцитов убирали. Полученные клетки дважды отмывали от соли средой Игла путем центрифугирования. Концентрация спленоцитов составляла 10⁶ в 1 мл.

Индукторы интерферона. Для стимуляции продукции α – интерферона применяли вирус болезни Ньюкасла ВБН (10⁵ ЭИД₅₀), в качестве индуктора γ –интерферона- стафилококковый энтеротоксин А -СЭА (1,0 мкл). ВБН – индуцированные пробы спленоцитов инкубировали при температуре +37°С с 5% СО₂ в течение 24 часов, а СЭА – индуцированные – в течение 72 часов.

Определение активности интерферонов осуществляли микрометодом титрования в 96- луночных пластиковых планшетах с монослоем клеток мышиных фибробластов L₉₂₉, выращенных в среде Игла с 8% телячьей эмбриональной сыворотки с 5% СО₂. В качестве тест- вируса использовали вирус энцефаломиокардита мышей ЕМС, штамм Индиана. Вирусы хранили хранили в жидком азоте с добавлением в качестве криопротектора 7,5% ДМСО. За титр интерферона принимали величину, обратную разведению интерферона, вызывающую 50% защиту монослоя клеток от цитопатического действия тест-вируса ЕМС. В качестве референс-препарата как индуктора интерферона использовали препарат Индуктора интерферона бактериальный жидкий (РК- Гос. рег. АНД 42-33-68-11 от 9.01.2012)

Статистическую обработку результатов проводили по Ойвину И.А. [4].

Действие глифосата на продукцию α - и γ – интерферонов спленоцитами мышей в опытах in vitro.

Взвесь спленоцитов разливали в пенициллиновые флаконы и вносили глифосата расчета 0,0015; 0,03; 0,06; 0,12; 0,25; 0,5 мкг/мл. В контрольные пробы культуры вносили эквивалентное количество среды Игла. Клетки селезенки инкубировали в течение 24 часов при температуре +37°С, затем центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об /мин, после чего среду удаляли и добавляли соответствующий индуктор интерферона. После дополнительной инкубации с индуктором, пробы обрабатывали и определяли в них активность интерферонов. Результаты представлены а таблице 1. Они показывают, что предварительная обработка спленоцитов в течение 24 часов подавляет продукцию как α –, так и γ – интерферонов. Причем, степень супрессорного действия глифосата была пропорциональна концентрации препарата, воздействовавшего на культивируемые спленоциты.

Таблица 1 - Влияние различных концентраций глифосата на продукцию

α – и γ – интерферонов в культуре спленоцитов мышей

Дозы ГФ (в мкг/мл)	Активность α- интерферона (ед./мл.)	Активность γ – интерферона (ед./мл.).
0,5	6+ 0,6	12+ 1,3
0,25	14+ 3,7	20+ 2,4
0,12	24+ 8,4	44+ 14,5
0,06	48+ 12,6	179+ 15,7
0,03	96+ 6,4	196+ 12,8
0,0015	112+ 12,3	204+ 14,6
0 (контроль).	153+ 12,8	320+ 11,6

Изучение продукции α – и γ – интерферонов в культуре спленоцитов мыши после парентерального введения глифосата мышам.

Мышам ежедневно вводили препарат глифосата подкожно по 50,0 мкг/мл в течение или 15, или 30, или 45 дней. Контрольным животным вместо ГФ вводили физиологический раствор. Затем животных, получивших или 15, или 30 или 45 инъекций глифосата, а так же контрольных животных забивали, получали селезенки и готовили культуру спленоцитов в среде Игла с 8% телячьей эмбриональной сывороткой, в концентрации 10⁶ кл/мл. Взвесь распределяли по 1,0 мл в пенициллиновые флаконы и вносили соответствующие индукторы интерферон. После дополнительной инкубации, пробы обрабатывали и в надосадочной жидкости определяли активность интерферонов.

Из приведенных данных в таблице 2 видно, что с увеличением количества парентеральных инъекций глифосата мышам, параллельно увеличилась степень угнетения процесса образования и α – и γ – интерферонов спленоцитами этих животных, в опытах in vitro.

Таблица 2- Влияние парентеральных инъекций глифосата мышам на продукцию α – и γ – интерферонов спленоцитами мыши in vitro

Классы интерферонов	Активность интерферонов ( ед/мл.) в культуре спленоцитов, взятых от мышей , получивших глифосат: (M+m).
	Физиол. раствор (контроль)	15 инъекций ГФ.	30 инъекций ГФ.	45 инъекций ГФ.
α –	120+ 12,5	73+ 9,2	44+ 8,7	21+ 6,2
γ –	116+ 17,4	62+ 8,4	38+ 12,4	18+ 7,1

Нами проведены исследования воздействия глифосата на клеточную культуру спленоцитов селезенки мыши в отношении продукции α- и γ-интерферонов. Условием для изучения влияния глифосата на интерферонпродуцирующую активность культуры клеток являлось отсутствие выраженной токсичности изучаемого ядохимиката для клеток. В результате предварительных исследований нами была определена пороговая доза пестицида, не оказывающая токсического действия (концентрации от 0,004 до 0,008 мг/мл при инкубации с клетками в течение 48 часов [5].

Ранее было показано использование культуры спленоцитов мыши, для оценки действия эндогенного пептида при внутрибрюшинном введении мышам [6]. Наши исследования подтверждают чувствительность метода клеточных спленоцитов селезенки мыши для изучения действия пестицидов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что продукция интерферонов под воздействием глифосата как в условиях in vitro, так и в спленоцитах, взятых у мышей после длительного воздействия препарата мышам статистически значимо снижается.

Таким образом, в результате проведенных исследований показано, что глифосат при воздействии на клетки спленоцитов мыши в концентрациях, не оказывающих токсического действия на клетки, способствует снижению продукции α - и γ – интерферонов примерно в 3 раза в сравнении с культурой спленоцитов в контроле.

Литература

1.Мельников Н.Н. Пестициды – химия, технология, применение. – М.,1990.

2. Панина Н.К. Лабораторный контроль за остаточным количеством пестицидов в окружающей среде // Гигиена и санитария. Т- 2010. - № 3. – С. 77-80.

3. Справочник по пестицидам (гигиена применения и токсикология)/ под ред. Л.И.Медведя. – 1997.

4. Ойвин И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований // Патол. физиол. и эксперим. Терапия. – 1964. - № 4. – С.76-79.

5 И.А.Ленева, И.Т.Федякина, М.Ю.Еропкин, Н.В.Гудова , А.А. Романовская , Д.М.Даниленко, С.М.Виноградова, А.Ю.Лепешкин, .М.Шестопалов Изучение противовирусной активности химиопрепаратов в культуре клеток и на модели животных // Вопросы вирусологии 2010, № 3, С.19-27.

6. Гейн С.В. , Баева Т.А., Небогатиков В.О. Влияние α-эндорфина на пролиферативную и секреторную активность спленоцитов in vivo // Иммунология . – 2012. –Т.33. - №2. –С.102 – 103.