КОРРЕКЦИЯ ИММУННЫХ И МЕТАБОЛИЧЕСКИХ
НАРУШЕНИЙ ПРИ ОСНОВНЫХ ВИДАХ ГИПОКСИИ
Д.м.н. Николаев С.Б., *проф. Конопля
А.И., проф. Куликовский В.Ф., *проф. Быстрова Н.А.
ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный
исследовательский университет»
*ГБОУ ВПО «Курский государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Аннотация: цель
работы - установить
характер и степень иммунометаболических нарушений при основных видах гипоксии,
разработать способы фармакологической коррекции. Использованы экспериментальные
модели интервальной гипоксической гипоксии с гиперкапнией, острой гемической и гистотоксической гипоксии. Изучены иммунометаболические
эффекты в условиях гипоксии препаратов: «мексикор», «фосфоглив», «гипоксен»,
«эспа-липон» и их комбинаций.
Установлено, что основные виды экспериментальной гипоксии отличаются
степенью активации перекисного окисления липидов, соотношением угнетения клеточного,
гуморального иммунитета и факторов неспецифической защиты, иммуносупрессорным
профилем сыворотки крови, дифференцированным изменением продукции стабильных
метаболитов NO, сопровождаются нарушением структурно-функциональных свойств
эритроцитов, уменьшением их энергетического и антиоксидантного потенциала. Различные
механизмы реализации иммуносупрессии при гипоксии диктуют необходимость
дифференцированного подхода к их фармакологической коррекции.
Ключевые слова: гипоксия, иммунометаболические
нарушения, дифференцированная иммунокоррекция, «мексикор», «фосфоглив», «гипоксен»,
«эспа-липон».
I. Введение. Изучение проблем патогенеза гипоксии
и патогенетического обоснования принципов медикаментозной коррекции метаболических
и функциональных расстройств, свойственных гипоксическим состояниям,
чрезвычайно актуально до настоящего момента [23]. Последнее определяется тем,
что гипоксия является ведущим патогенетическим фактором развития многих
заболеваний инфекционной и неинфекционной природы, терапевтического и
хирургического характера [3,8,16,24]. Однако при этом, иммунные нарушения, возникающие при гипоксии различного генеза, и
механизмы их развития остаются все еще недостаточно изученными [15]. В
связи с этим очевидно, что, несмотря на широкие возможности применения разнообразных
по месту приложения действия антиоксидантов и антигипоксантов, до настоящего
момента отсутствует систематизация данных относительно патогенетического
обоснования эффективности и целесообразности применения тех или иных способов
медикаментозной коррекции иммунометаболических расстройств при гипоксии
различного генеза.
II. Постановка
задачи
Цель работы - установить характер и степень
иммунометаболических нарушений при основных видах системной гипоксий,
разработать способы фармакологической коррекции
Материалы и методы.
Эксперименты
выполнены на крысах Вистар массой 180–210 г. с соблюдением принципов,
изложенных в «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для
экспериментальных и других целей».
Интервальную
гипоксическую гипоксию (ГипГ) вызывали путем помещения крыс в гермокамеры
одинакового объема до появления признаков терминальной стадии гипоксии 1 раз в
сутки в течение 5 дней с интервалом в 24 часа. Острую гемическую гипоксию (ОГГ)
моделировали одномоментной кровопотерей из бедренной вены из расчета 10 мл/кг веса.
Гистотоксическую гипоксию (ГТГ) моделировали
путем пятикратного через 24 часа внутрибрюшинного введения нитропруссида натрия
в дозе 1 мг/кг веса [13].
У
экспериментальных животных оценивали показатели, характеризующие адаптивный и
врожденный иммунитет. О выраженности гуморального иммунного ответа (ГИО) на
эритроциты барана (ЭБ) судили по количеству антителообразующих клеток (АОК) в
селезенке [6]. Клеточный иммунитет оценивали в реакции гиперчувствительности
замедленного типа (ГЗТ), индуцированной ЭБ, по разнице масс регионарного и
контрлатерального лимфоузлов (РМЛ) [22]. Функционально-метаболическая активность
(ФМА) нейтрофилов определялась по фагоцитарному индексу и числу (ФИ и ФЧ) [11],
реакции восстановления нитросинего тетразолия в спонтанной (НСТ-сп.) и
стимулированной опсонизированным (НСТ-инд. оз) или неопсонизированным зимозаном
(НСТ-инд. нз) [4].
Интенсивность
перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантный баланс оценивали по
концентрации в сыворотке крови малонового диальдегида (МДА), диеновых
конъюгатов (ДК) [20], активности каталазы [12] и супероксиддисмутазы
эритроцитов (СОД) [10].
Иммуносупрессорный
потенциал крови оценивали по концентрации в сыворотке липопротеидов низкой
плотности (ЛНП) [9] и гликозаминогликанов (ГАГ) [14], α-1-ингибитора
протеаз (ААП) и α-2-макроглобулина (АМГ) [18].
Концентрацию стабильных метаболитов оксида азота (смNO) в
сыворотке крови определяли с использованием реактива Грисса [2].
Энергообеспечение
эритроцитов оценивали по содержанию в них аденозинтрифосфата (АТФ) и
2,3-бисфосфоглицерата (БФГ) [1]. Также определяли сорбционные свойства
эритроцитов: сорбционную способность и емкость их гликокаликса (ССЭ и СЕГ) [19,21].
О
метаболической активности лимфоцитов судили по содержанию в них фруктозо-2,6-дифосфата
(ФДФ) [5].
В работе использовались следующие препараты: «мексикор» (ООО «ЭкоФармИнвест»,
Россия); «фосфоглив» (НИИ «Биомедхимии» РАМН, Россия), гипоксен (ЗАО
«Корпорация Олифен», Россия); «эспа-липон»
(Esparma
GmbH, Германия). Способ введения
препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в аннотациях по
использованию препаратов. Перерасчет доз с человека (средний вес 70 кг) на животных – белых крыс
производился в сторону увеличения в 5,9 раза [17]. Первое введение препаратов
выполнялось за 1 час до моделирования гипоксии, последующие – по схеме.
Таблица 1
Схемы применения препаратов
|
№ п/п
|
Модель
гипоксии
|
Препарат
|
Способ
введения
|
Однократная доза, мг/кг
|
Интервал между
введением,
часы
|
Количество дней
|
|
1.
|
ГипГ
|
«Мексикор»
|
Внутрибрюшинно
|
10
|
24
|
5
|
|
2.
|
ОГГ
|
«Эспа-липон»
|
Внутрибрюшинно
|
50
|
24
|
5
|
|
«Фосфоглив»
|
Внутрибрюшинно
|
200
|
24
|
5
|
|
3.
|
ГТГ
|
«Мексикор»
|
Внутрибрюшинно
|
10
|
24
|
5
|
|
«Гипоксен»
|
Внутрижелудочно
|
80
|
8
|
5
|
Достоверность
статистических различий средних арифметических величин оценивалась с
использованием критериев Стьюдента с поправкой Бонферрони и Крускала-Уоллиса.
Нормальность распределения проверялась критерием Шапиро-Уилка. Статистически
значимыми считали различия с p<0,05.
III.
Результаты. Исследованные
три вида системной гипоксии характеризовались развитием разной степени
выраженности супрессии гуморального и клеточного иммунного ответа. ОГГ и ГТГ сопровождались значительным
снижением уровня ФДФ в лимфоцитах (маркер метаболической активности). При ГТГ
эти изменения были наиболее выраженными. ГипГ характеризовалась недостоверным
уменьшением уровня ФДФ в лимфоцитах. Поэтому, вероятно, в условиях ГипГ супрессия
ГИО и ГЗТ на ЭБ обусловлена в большей степени не нарушением метаболизма иммуноцита,
а воздействием на него иммуносупрессирующих субстанций (табл. 2).
Снижение
показателей НСТ-теста с неопсонизированным зимозаном (более энергоемкий
процесс) при параллельном увеличении с опсонизированным в ряду ГипГ-ОГГ-ГТГ,
свидетельствовало о том, что при ГипГ роль в угнетении метаболической
активности нейтрофилов принадлежит ингибирующему влиянию на их рецепторный
аппарат иммуносупрессирующих субстанций, при ГТГ – энергетической составляющей,
при ОГГ – сбалансированному влиянию этих факторов. Угнетение фагоцитарной активности
нейтрофилов было наиболее выраженным при ГТГ и менее выраженным при ОГГ и ГипГ
(табл. 2).
При всех видах
гипоксий наблюдалось уменьшение активности антиоксидантных ферментов.
Статистически достоверное повышение концентрации продуктов ПОЛ и смNO
отмечалось только при ГипГ и ОГГ. При ГТГ уровень последних наоборот снижался.
Доказанной иммуносупрессорной активностью обладают ЛНП, ГАГ и антипротеазы.
Каждая форма системной гипоксии характеризовалась своим иммуносупрессорным
профилем (табл. 2).
Таблица 2
Иммунометаболические
нарушения при основных видах системной
гипоксии
(5-е сутки) (М±m)
|
№ п/п
|
Показатели
|
Контроль
|
ГипГ
|
ОГГ
|
ГТГ
|
|
Группа 1
|
Группа 2
|
Группа 3
|
Группа 4
|
|
1.
|
АОК
|
25,7±2,1
|
13,1±1,2*1
|
9,6±0,8*1,2
|
15,8±1,3*1,3
|
|
2.
|
РМЛ
|
5,3±0,4
|
3,4±0,2*1
|
2,7±0,2*1,2
|
2,8±0,25*1,2
|
|
3.
|
ФДФ
лимфоцитов
|
0,97±0,09
|
0,89±0,09
|
0,65±0,06*1,2
|
0,43±0,03*1-3
|
|
4.
|
НСТ сп.
|
0,84±0,03
|
0,74±0,03*1
|
0,71±0,02*1
|
0,68±0,02*1
|
|
5.
|
НСТ инд. нз
|
1,35±0,05
|
1,19±0,04*1
|
1,01±0,03*1,2
|
0,87±0,02*1-3
|
|
6.
|
НСТ инд. оз
|
1,66±0,06
|
1,26±0,04*1
|
1,19±0,04*1
|
1,31±0,05*1,3
|
|
7.
|
ФИ
|
43,4±3,8
|
28,7±2,4*1
|
20,9±1,7*1,2
|
18,2±1,5*1,2
|
|
8.
|
ФЧ
|
1,7±0,2
|
1,0±0,1*1
|
0,8±0,1*1
|
0,7±0,07*1,2
|
|
9.
|
МДА
|
2,4±0,14
|
5,3±0,31*1
|
3,6±0,23*1,2
|
2,2±0,12*2,3
|
|
10.
|
ДК
|
3,9±0,24
|
8,5±0,55*1
|
5,8±0,39*1,2
|
3,6±0,22*2,3
|
|
11.
|
СОД
эритроцитов
|
52,1±3,2
|
30,1±2,2*1
|
33,2±2,4*1
|
41,7±2,9*1-3
|
|
12.
|
Каталаза
|
24,8±1,7
|
13,1±0,9*1
|
16,4±1,2*1,2
|
15,8±1,1*1
|
|
13.
|
ЛНП
|
23,9±1,8
|
37,4±2,7*1
|
53,1±3,8*1,2
|
28,1±2,0*2-3
|
|
14.
|
ГАГ
|
0,25±0,02
|
0,39±0,03*1
|
0,55±0,04*1,2
|
0,28±0,02*2-3
|
|
15.
|
ААП
|
25,3±1,8
|
27,3±2,1
|
39,1±2,6*1,2
|
32,8±2,3*1-3
|
|
16.
|
АМГ
|
1,7±0,13
|
1,9±0,14
|
3,5±0,25*1,2
|
2,6±0,18*1-3
|
|
17.
|
смNO
|
4,9±0,25
|
7,8±0,44*1
|
6,3±0,35*1,2
|
4,0±0,23*1-3
|
|
18.
|
АТФ
|
1,8±0,2
|
1,7±0,2
|
0,6±0,1*1,2
|
1,6±0,15*3
|
|
19.
|
БФГ
|
5,6±0,3
|
5,4±0,3
|
3,3±0,2*1,2
|
5,2±0,25*3
|
|
20.
|
ССЭ
|
15,6±1,1
|
21,2±1,5*1
|
39,4±2,9*1,2
|
10,1±0,7*1-3
|
|
21.
|
СЕГ
|
0,95±0,07
|
1,24±0,08*1
|
1,56±0,11*1,2
|
0,75±0,05*1-3
|
Примечание: ААП - мкмоль/л; АМГ - мкмоль/л; АОК – 103/селезенку;
АТФ – мкмоль/мл эритроцитов; БФГ - мкмоль/мл эритроцитов; ГАГ –
г/л; ДК - DD233 на 1 мл; ИАФ -
абс.; Каталаза - мКат/л; ЛНП–
условные единицы; МДА - мкмоль/л; НСТ инд.
нз, НСТ инд. оз, НСТ-сп. – единицы оптической плотности; РМЛ -
мг; СОД – ЕД на мл эритроцитов; ССЭ - %; СЕГ - 10-12 г/эритроцит; ФДФ -
пМ/106 лимфоцитов; ФИ – %; ФЧ - асб.; смNO - мкмоль/л
Учитывая существенную роль
эритроцитов в развитии иммуносупрессии и реализации иммунотропных эффектов
фармакологических препаратов, были исследованы их физико-химические и
метаболические свойства при изучаемых видах гипоксии. При ОГГ отмечалось уменьшение
в эритроцитах содержания макроэргических соединений. ГипГ и ОГГ
характеризовались увеличением сорбционной способности эритроцитов, а ГТГ,
наоборот, снижением (табл. 2).
С учетом установленных нами
иммунометаболических нарушений при различных видах системной гипоксии для
коррекции при ГипГ был использован «мексикор», при ОГГ – «эспа-липон», «фосфоглив»
и их комбинация, при ГТГ – «гипоксен», «мексикор», а также их сочетание.
При
ГипГ использование «мексикора» приводило к нормализации практически всех
исследуемых показателей, за исключением активности СОД и каталазы. При ОГГ «фосфоглив»
корригировал показатели иммунного ответа, уменьшал продукцию смNO, ЛНП, ГАГ,
снижал сорбционные свойства эритроцитов. «Эспа-липон» нормализовал метаболическую
активность лимфоцитов, эритроцитов и уровень смNO, уменьшал сорбционные
свойства эритроцитов и концентрацию большей части иммуносупрессирующих
метаболитов. При сочетанном использовании «фосфоглив» оказывал протективное
влияние на «эспа-липон» в отношении функции иммуноцитов, гепатоцитов и
эритроцитов, что позволяло предотвратить развитие иммунометаболических
нарушении при ОГГ. В условиях ГТГ «мексикор», и в большей степени «гипоксен»,
корригировали измененные показатели, но их нормализация достигалась только при
сочетанном использовании этих препаратов (табл. 3).
IV. Выводы. Сопоставляя
данные литературы и результаты собственных исследований, можно прийти к
заключению о том, что различные виды гипоксии характеризуются возникновением
состояния, которое можно условно назвать энергозависисимым иммунодефицитом.
Основанием
для такого заключения служит возможность
эффективной коррекции иммунологических функций путём применения соединений,
превалирующей функцией которых является регуляция энергетического обмена:
гликолиза, цикла трикарбоновых кислот, работы окислительной цепи митохондрий и
дополнительно обладающих антиоксидантными и мембраностабилизирующими
свойствами. Это свидетельствует о взаимосвязанности и взаимокомпенсации
энергодонорных процессов на уровне отдельных клеток и организма в целом [7].
Основной точкой
приложения в реализации иммунотропных эффектов исследованных препаратов было
предотвращение активации перекисного окисления липидов в органах мишенях
гипоксии и выделения ими субстанций, способных не только самостоятельно
угнетать функцию иммуноцитов, но индуцировать появление таких же свойств у
эритроцитов. «Мексикор», «эспа-липон», «фосфоглив» и сочетание «эспа-липона» с «фосфогливом»
уменьшали сорбционные свойства эритроцитов. Последняя комбинация также нормализовала
их энергетический статус. Эти изменения, по-видимому, препятствовали
модификации эритроцитов иммуносупрессирующими метаболитами и приобретению ими
аналогичных свойств. Кроме того, исследуемые препараты препятствовали гиперпродукции
NO, способного оказывать прямое
цитотоксическое действие на иммуноциты, а также улучшали метаболический статус
лимфоцитов.
Литература.
1. Виноградова И.Л., Багрянцева С.Ю.,
Дервиз Г.В. Метод одновременного определения
2,3-ДФГ и АТФ в эритроцитах // Лаб. дело. – 1980. – №7. – С.424-426.
2. Голиков П.П. Оксид азота в клинике
неотложных заболеваний – М., 2004. – 315 с.
3. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга – М.:
Медицина, 2001. – 327 с.
4. Зинкин В.Ю., Годков М.А. Способ количественной оценки кислородзависимого
метаболизма нейтрофильных гранулоцитов человека // Клинич. лаб. диагностика. –
2004. – №8. – С.26-29.
5. Изменение содержания
фруктозо-2,6-бисфосфата в лимфоцитах периферической крови больных сахарным
диабетом / Коровкин Б.Ф., Беляева Н.Ф., Краевой С.А. и др. // Вопр. мед. химии.
– 1999. – Т.45, вып. 3. – С. 232-237.
6.
Иммунологические
методы / под ред. Г. Фримеля. – М., 1987. – 472 с.
7. Иммунометаболические эффекты
регуляторов энергетического обмена при нарушении гомеостаза / Г.А. Лазарева и
др. // под ред. Л.Г. Прокопенко – Курск, 2006. – 329 с.
8. Использование серотонина адипината и мексикора для
повышения эффективности консервативной терапии критической ишемии нижних
конечностей / Николаев С.Б., Симоненков А.П., Лазаренко
В.А. и др. // Врач-аспирант, №5(42), 2010. - С. 30-40.
9. Лабораторные методы исследования в
клинике / под ред. В.В. Меньшикова. – М.: Медицина, 1987. – 365 с.
10. Макаренко Е.В. Комплексное
определение активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы в эритроцитах
больных с хроническими заболеваниями печени //
Лаб. дело. – 1988. – №11. – С.48-50.
11. Медведев А.Н., Чаленко В.В. Способ
исследования поглотительной фазы фагоцитоза // Лаб. дело. – 1991. – №2. –
С.19-20.
12. Метод определения активности
каталазы / Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова Н.О., Токарев В.Е. // Лаб.
дело. – 1988. – №1. – С.16-18.
13.
Методические рекомендации по экспериментальному
изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических
средств / под ред. Л.Д. Лукьяновой и др. – М., 1990. – 18 с.
14. Мурашов Б.Ф., Осадчук М.А., Капустин В.М. Содержание гликозаминогликанов
сыворотки крови при вирусном гепатите // Лаб. дело. – 1986. – № 12. –
С.715–716.
15.
Николаев С.Б., Быстрова Н.А., Конопля А.И. Иммуносупрессия
при различных видах гипоксии и механизмы ее развития // Вестник новых медицинских технологий. 2009. Т. XVI. № 3. С.
163-166.
16.
Погорелов
В.М., Козинец Г.И. Анемия - гипоксия,
гемотрансфузия – СПб., 2005 – 120 с.
17.
Руководство
по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ
/ под ред. В.П. Фисенко. – М., 2000. – 398 c.
18. Русаков С.В., Кубышкин А.В. Микрометод
определения в крови альфа-1-ингибитора протеаз и альфа-2-макроглобулина // Лаб.
дело. – 1995. – №1. – С.8-10.
19. Семко
Г.А. Структурно-функциональные
изменения мембран и внешних примембранных слоев эритроцитов при гиперэпидермопоэзе
// Укр. биохим. журн. – 1998. – Т.70, №3. – С.113-118.
20.
Современные
методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. – М.: Медицина, 1977. – С.392.
21. Тогайбаев А.А., Кургузкин А.В., Рикун И.В. Способ диагностики
эндогенной интоксикации // Лаб. дело. – 1988. – №9. – С.22-24.
22.
Федосеева
В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В. Руководство по иммунологическим и
аллергологическим методам в гигиенических исследованиях – М., 1993. – 319 с.
23.
Чеснокова
Н.П. Общая патология: учеб. пособие для студ. высш. мед. учеб. заведений. – М.:
Academia, 2006.
– 336 c.
24.
Шевченко
Ю.Л. Гипоксия. Адаптация. Патогенез. Клиника – СПб.: ЭЛБИ-СПб., 2000. – 384 с.
