Современные подходы к
повышению элективных свойств
питательных сред для
культивирования пневмококков
ФГБУ «НИИ детских инфекций ФМБА
России», Санкт-Петербург
Л.И. Железова, А.С. Кветная
Аннотация
В ФГБУ НИИДИ ФМБА
России разработан способ приготовления
питательной среды, основанный на замене нативной сыворотки животного стандартным
препаратом – лецитином, производным холина. Добавление лецитина к питательному бульону в пределах
0,1 – 0,01 г/л оказывало стимулирующий
эффект на размножение пневмококков, стабилизацию популяции in vitro.
Четырех-пятикратное пассирование штамма на данной среде (в отличие от широко используемого 20% сывороточного
бульона) приводило к усилению капсулообразования, повышению вирулентности
и выраженной ß-гемолитической
активности.
Ключевые слова: пневмококк,
пневмококковые инфекции, диагностика, лецитин.
I. Введение
Заболевания, вызываемые пневмококком,
являются серьезной проблемой здравоохранения во всем мире в связи с
повсеместным распространением, разнообразием клинических форм (менингит,
пневмония, сепсис, отит, синусит и др.), развитием инвазивных форм, нередко с
осложненным течением (20-40%%) и
высокой частотой формирования
бактерионосительства (до
60-70%%) [1, 2, 3, 4, 5]. Пневмококковая инфекция
(ПИ) признается ВОЗ ведущей причиной заболеваемости и
смертности во всех регионах мира. Особенно
актуальна проблема ПИ среди детей первых лет жизни, пожилых людей и лиц
с хроническими болезнями. Наибольшая частота
заболеваемости приходится на детей первых 2 лет жизни и пожилых людей [1,2,3,4,5]. Пневмококк – это условно патогенный
микроорганизм, колонизирующий слизистые
оболочки верхних дыхательных путей его колонизация сдерживается механизмами
местной иммунной защиты. Морфологически Streptococcus pneumonia представлен как инкапсулированный грамположительный
диплококк, окруженный полисахаридной капсулой – главным фактором патогенности и
вирулентности микроорганизма, основанный на способности ослаблять фагоцитоз
клеток пневмококка [6,7,8].
Разнообразие клинических форм пневмококковых инфекций (ПИ) и высокая
частота носительства в детских
дошкольных учреждениях объясняется неоднозночной восприимчивостью к развитию
генерализованных форм ПИ, так и неодинаковой способностью разных штаммов
возбудителя колонизировать слизистые и
инвазироваться во внутреннюю среду организма. В этой связи значимость приобретают
вопросы, связанные с изучением физиологических свойств пневмококка.
Установлено, что пневмококк
отличается высокой прихотливостью к условиям культивирования. Он требует для
своего развития максимально обогащенных искусственных питательных сред с содержанием большого набора аминокислот.
Однако, основной питательной
потребностью пневмококка, как известно, является холин. Добавление к
жидким или плотным питательным основам 10-15%
нормальной лошадиной сыворотки
обеспечивает в той или иной степени его потребность в холине. Развитие пневмококка на плотных питательных средах стимулируется
повышенным содержанием СО2 в атмосфере, поэтому пневмококк относится к факультативным
анаэробам, так как не имеет цитохрома и может утилизировать кислород атмосферы
при помощи энзиматической системы флавопротеина. Необходимо заметить, что около
10% штаммов вообще не развивается без избытка углекислоты. В результате дыхания
образуется перекись водорода, которую микроорганизм не в состоянии обезвредить,
так как не содержит каталазы. Поэтому в состав питательных сред для
культивирования пневмококка включают кровь (эритроциты), субстракт, содержащий
этот фермент. Предпочтительным для пневмококка являются среды с пониженным
парциальным давлением кислорода (бульон, заполняющий большую часть пробирки,
полужидкий агар, тиогликолевые среды), на которых он может развиваться и без
добавления крови, источника каталазы. Оптимум для культивирования пневмококка —
рН 7,6 и 35-370С, но рост возможен в пределах рН 7,0-7,8 и при
температурных границах роста — 25-420С [5, 6, 7].
Учитывая биологическую
потребность пневмококка в холине, изучение эффективности действия препарата
фосфотидилхолина (лецитина) на биологические свойства пневмококка с использованием питательной среды с лецитином
явилось целью нашего исследования.
II. Цель исследования
Разработать и изучить эффективность питательной среды с фосфотидилхолином (лецитином) для выделения и культивирования Streptococcus pneumoniae.
В России широко используемой питательной средой для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств пневмококка является 5%
кровяной агар [8]. 5% кровяной агар используется как основная питательная среда
для первичного посева отделяемого
дыхательных путей (отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов,
полученное при бронхоскопии или при отсасывании содержимого бронхов через
трахеостому больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; и др.) и
ЛОР - органов. Однако, 5%
кровяной агар, согласно прописи [ 8],
не относится к эффективным питательным средам, в связи с отсутствием
сыворотки животного, он имеет низкие ростовые свойства для прихотливых
микроорганизмов, в частности для Streptococcus pneumoniae, Streptococcus
pyogenes, 
-гемолитических Streptococcus
spp. Развитие
пневмококка на плотных питательных
средах стимулируется повышенным содержанием СО2 в атмосфере,
поэтому пневмококк относится к
факультативным анаэробам, так как не имеет цитохрома и может утилизировать
кислород атмосферы при помощи энзиматической системы флавопротеина. Необходимо
заметить, что около 10% штаммов вообще не развивается без избытка углекислоты.
В результате дыхания образуется перекись водорода, которую микроорганизм не в
состоянии обезвредить, так как не содержит каталазы. Поэтому в состав
питательных сред для культивирования пневмококка включают кровь (эритроциты),
субстракт, содержащий этот фермент. Предпочтительным для пневмококка являются
среды с пониженным парциальным давлением кислорода (бульон, заполняющий большую
часть пробирки, полужидкий агар, тиогликолевые среды), на которых он может
развиваться и без добавления крови, источника каталазы. Оптимум для
культивирования пневмококка — рН 7,6 и 35-370С, но рост возможен в
пределах рН 7,0-7,8 и при температурных границах роста — 25-420С
[4,6,7]. При соблюдении питательных
потребностей и других условий роста, на 5% кровяном агаре с 10-15% сыворотки животного пневмококк
формирует мелкие (0,5 - 1,2 мм в
диаметре ) округлые, блестящие, бесцветные с ровным краем, мягкой консистенции
и α-гемолизом
колонии. 18-24 часа колонии имеют полусферическую форму с уплотненным центром, который
образуется в результате аутолиза. При росте на жидких питательных средах
наблюдается диффузное помутнение без пленки
[4, 6, 7]. Известны ряд сред для
выделения и культивирования пневмококка, такие как триптический перевар мяса по
Хоттингеру, который содержит: 70-75%
гидролизата мяса по Хоттингеру или казеина (1,8-2,0 г/л аминного азота); 20-25%
гидролизата бычьих сердец (1,4-1,5 г/л аминного азота); 1,7-2,0% агара; воду
дистиллированную 1000,0 мл; рН 7,6±0,1. Эту основу стерилизуют при 121°С 20 мин.
Увеличение ростовых свойств питательной среды обусловлено наличием в ней: 1)
дрожжевого экстракта, который является источником углерода и азота с повышенной
питательной ценностью, источником витаминов группы В, витамина Д и других
факторов роста - пуриновых и пиримидиновых оснований. Белок дрожжей
сбалансирован по аминокислотному составу и по этому показателю близок к
животному белку; 2) сыворотки крупного рогатого скота, необходимой для
роста Streptococcus pneumoniae и проявления им типичной морфологии и
культуральных свойств: нежные полупрозрачные четко очерченные колонии диаметром
около 1 мм или они могут быть плоскими с углублением в центре. Кроме того,
сыворотка стимулирует образование капсул Streptococcus pneumoniae [4, 6 ,7]; 3)
эритроцитарной массы добавление, которой, во-первых, имеет диагностическое
значение - определение гемолитических свойств микроорганизма (
,
, 
-гемолиз), во-вторых, обеспечивает
эффективный рост Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, -гемолитические Streptococcus spp.
[6].
III. Результаты
В НИИ детских инфекций (Санкт-Петербург, Россия) учитывая
физиологическую потребность пневмококка
в холине разработан способ
приготовления высокоэффективной питательной среды, основанной на замене
нативной сыворотки животного стандартным препаратом фосфотидилхолином
(лецитином), производным холина [9]. С
этой целью использован лецитин (Lecitin-Standart,
выпускаемый предприятием по производству бактерийных препаратов
г.Харьков, Украина)- производное холина. Состав среды (г/л): NaCl-5,0-6,0г, K2HPO4-0,5-1,0 г, лецитин- 0,1-0,01 г,
бульон Хоттингера (аминный азот 1,5-1,8 г/л) или коммерческий бульон
(Дагестанский НИИ питательных сред, г. Махачкала) до 1 л, pH 7,2-7,4. Приготовление среды: к стерильному и охлажденному бульону
(Хоттингера или коммерческому) ex tempore
стерильно добавляли 10% лецитина в пределах 1,0-0,01 г/л. Лецитин легко
растворялся в бульоне в течение 1-2 мин. Готовая среда – светло-соломенного
цвета с легкой опалесценцией. Для контроля использовали среду, приготовленную
на той же бульонной основе, но с добавлением 10% сыворотки рогатого скота
вместо лецитина. Испытания различных вариантов среды с лецитином (в пределах от
1,0 до 0,001 г/л бульона) проведено на шести клинических штаммах пневмококка
(№№ 789,1906,46 и 605, выделенных от детей с пневмонией, № 92- от ребенка с
гнойным менингитом и № 7858 – от ребенка с гнойным отитом), а также на двух
референс - штаммах (АТСС). Результаты культивирования двух штаммов (№
789, серовар 2 и № I, серовар I) на средах с различным содержанием
лецитина, показали что концентрация лецитина в среде 1,0 г/л оказывает
стимулирующий эффект только к 6-ти часам инкубации (КОЕ увеличивается на I lg). В более поздние сроки
инкубации (9, 18 и более часов),
наоборот, - наблюдается почти полное исчезновение жизнеспособных клеток
пневмококка. Содержание лецитина в среде 0,001 г/л не оказывала влияния на рост
популяции пневмококка. За все время наблюдения показатель КОЕ в исследуемых пробах оставался практически
равным КОЕ инокулята (2,5х105м. кл/мл). Лецитин в концентрации от 0,1 до 0,01 г/л (0,1; 0,07; 0,05; 0,02;
0,01 г/л) уже к 6-ти часам инкубации как клинических, так и АТСС - штаммов
пневмококка оказывал стимулирующее действие на их рост. К 6-ти часам инкубации наблюдается
увеличение КОЕ на 1- 2 lg, к 9-ти часам – на 2 – 4 lg. Элективные свойства среды с
лецитином были испытаны и на
клинических образцах.
Исследованы цереброспинальная
жидкость (ЦСЖ) и гной из уха, полученные от 132 больных гнойным менингитом (n=84) и гнойным отитом (n=48). Посевы биологических проб на испытуемую и контрольную
среды проводили не позже, чем через 2 – 3 часа после взятия образцов.
Инокулированные образцами пробирки со средами инкубировали в течение 9 – 18
часов при 36ºC в условиях повышенного содержания СО2 («свечной
сосуд»). Пересев исследуемого материала из испытуемой и контрольной сред на 5%
кровяной агар для выделения пневмококка
проводили через 9 – 18 часов инкубации. При этом учитывали наличие или
отсутствие роста, отмечали диаметр колоний, их форму. Дальнейший ход
исследований проводился общепринятыми методами идентификации. Сравнительное
исследование образцов ЦСЖ и отделяемого уха, полученных от больных ПИ, на
средах с лецитином и без него показало, что по чувствительности среда без
лецитина (контрольная среда) значительно уступает среде с лецитином (испытуемая
среда). Из ЦСЖ и отделяемого уха на среде с лецитином пневмококк был выделен от
37 детей (100%) в то время, как на контрольной среде из этих же образцов – от
12 (66,6±13,6%) (p<0,01). Причем, штаммы пневмококка в атипичной форме
выделялись на контрольной среде в 2 раза чаще, чем на испытуемой среде (из
общего числа выделенных штаммов на каждой среде). Концентрация лецитина в простом питательном бульоне в
пределах 0,1 – 0,01 г/л оказывала стимулирующий
эффект на размножение, стабилизацию популяции in vitro и патогенные свойства
пневмококка. Четырех-пятикратное пассирование штаммов на данной среде (в
отличие от широко используемого 20%
сывороточного бульона) сохраняло видовые и типовые свойства пневмококка и приводило к усилению капсулообразования,
повышению вирулентности и выраженной
ß-гемолитической активности.
IV. Выводы
Таким образом, постоянный поиск путей
совершенствования питательных сред для
выделения и культивирования пневмококка обусловлен высокой прихотливостью этого микроорганизма к условиям
культивирования. Впервые разработанная в НИИДИ (Санкт-Петербург, Россия)
питательная среда на основе бульона Хоттингера (аминный азот, pH 7,2-7,4) с добавлением лецитина в пределах от 0,1 до 0,01 г/л обладает
высокими элективными свойствами по отношению к пневмококку и может
использоваться, во- первых - для накопления чистых культур пневмококка,
свободных от балластных белков крови, во-вторых - для эффективного выделения пневмококка при исследовании материала
из закрытых полостей (ЦСЖ, отделяемого ушей, плевральной жидкости и
крови). Полученные результаты
позволяют считать лецитин поставщиком холина – основного структурного компонента
тейхоевой (С-карбогидрат) и липотейхоевой кислот, составляющих клеточную стенку
пневмококка. Потребность пневмококка в
холине, хотя и не имеет непосредственного отношения к детерминантам патогенности, однако, видимо, существенна для экспрессии вирулентности
пневмококка в связи с обеспечением функции питания.
Литература
1. CDC.
Preventing Pneumococcal Disease Among Infants and Jung Children. MMWR-2000.-V
49. - № RR- 9.- H.1-24.
2. Козлов Р.С. Пневмококки: прошлое, настоящее и будущее. Смоленск: Смоленская
государственная медицинская академия, 2005. - 128 с.
3.
Покровский
В.И. Стрептококки и стрептококкозы / В.И. Покровский, Н.И. Брико, Л.А. Ряпис
//М.: Издательская группа «Гэотар-Медиа».2006. 541 с.
4.
Таточенко,
В.К. Пневмококковая инфекция: современный взгляд на проблему и профилактику /
В.К.Таточенко // Вопросы современной педиатрии. – 2007.- Т. 5. - № 1. – С.
107-112.
5.
Ряпис
Л.А. Проблема пневмококковых инфекций в России / Л.А. Ряпис, Н.И. Брико
//Эпидемиология и инфекционные болезни. 2010.- № 1.- С.4-8.
6. Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических
исследований: учебное пособие. Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной
А.С. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. - 600 с.
7. Выделение, идентификация и определение чувствительности кантибиотикам
Streptococcus pneumonia / Л.С.Страчунский, О.И.Кречикова, Р.С.Козлов,
Т.М.Богданович, О.У.Стецюк, М.М.Суворов, Л.К.Катосова, Л.А.Вишнякова,
М.Е.Фаустова // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2000.
- Т.2, № 1. С.88-98.
8. Приказ МЗ СССР № 535 от 22 апреля 1985 года «Об унификации микробиологических (бактериологических)
методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях
лечебно-профилактических учреждений».
9. Кветная, А.С. Экспериментальное
обоснование эффективности фосфотидилхолина (лецитина) на физиологию пневмококка
/ А.С. Кветная, Л.И. Железова // Журн. Медицинский алфавит.
Эпидемиология и гигиена. – 2013.- № 1.-
С. 18-21.
Железова Людмила Ильинична, кандидат
медицинских наук,
ст.н.с.
отдела микроэкологии человека
Кветная Ася Степановна, доктор
медицинских наук, профессор,
руководитель отдела микроэкологии
человека