Биологические науки/10. Генетика и цитология

Пичка В. В., Чемшит Ю. В., Нидельськая М. С., Россихин В.В.

Национальный технический университет «Харьковский политехнический институт», Харьков

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДОВ ТРАНСФОРМАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ И ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

В настоящее время с помощью трансформации плазмидной ДНК различных микроорганизмов решаются различные задачи по получению трансгенных белков для производства биологически активных веществ и научных исследований. В связи с большими перспективами использования этой технологии целью данного исследования являлся подбор оптимальных условий выделения плазмидной ДНК из культуры E.coli и ее использования для последующей трансформации. В работе использовались плазмидные векторы pUC18, pUC19, pQE и рТ32а, содержащие ген устойчивости к ампициллину, и штамм E.coli XL1-Blue. Было проведено сравнение различных методов выделения плазмидной ДНК и определение влияния ряда факторов на количественные и качественные показатели получаемого препарата. Также были подобраны оптимальные условия культивирования клеток. Для выделения ДНК из клеток использовались методы лизиса кипячением и метод щелочного лизиса.

Полученные результаты свидетельствуют о важной роли условий культивирования микроорганизмов, в частности, интенсивной аэрации и перемешивания культуры. Культивирование бактерий с достаточной аэрацией обеспечивало большую плотность клеток и больший выход плазмидной ДНК при выделении. В большинстве случаев более высокий выход плазмидной ДНК обеспечивал метод лкзиса клеток кипячением, что, по-видимому, было связано с более полным разрушением клеточных стенок. Было отмечено, что очистка ДНК смесью фенол-хлороформ приводило к значительным потерям исследуемого материала (до 50 %). Положительный эффект на количество ДНК в образцах имела инкубация с 70 % этанолом в течение получаса при -20°С на конечном этапе лизиса кипячением.

Полученная таким образом плазмидная ДНК очищалась от примесей РНК и геномной ДНК преципитацией ПЭГ, после чего обрабатывалась рестрицирующими эндонуклеазами для подтверждения структурной целостности. Результаты оценивались с помощью электрофореза в агарозном геле. При этом было обнаружено, что использование натрий-боратного буфера обеспечивает лучшее разделение анализируемых образцов ДНК, чем ТАЕ и ТВЕ.

Компетентные клетки для трансформации получали с помощью хлористого кальция. Было обнаружено, что компетентность клеток значительно возрастает, если инкубировать их перед воздействием плазмидной ДНК при 4°С в течение 12-24 часов. Отбор трансформантов производился но методу а-комплементации.

При сравнении результатов трансформации клеток различными плазмидами было выявлено, что рТ32а обеспечивала значительно меньший выход трансгенных клеток, чем pUC 18 и pUC19.

Можно предположить, что это связано с различием размеров этих плазмидных векторов - размер рТ32а около 6 kh, pUC18 и pTJC19 - 2,6 kb, и сложностью прохождения крупного плазмидного вектора через образовавшуюся нору в мембране компетентной клетки. Таким образом, использование оптимизированных методов получения плазмидной ДНК и трансформации бактериальных клеток позволило значительно увеличить эффективность трансформации.