Изучение влияния регуляторов роста на морфогенез пеларгонии королевской (Pelargonium
grandiflorum)
в культуре пыльников и микроспор
Корчагин А.В., Поляков А.В.
ГНУ ВНИИ овощеводства Россельхозакадемии,
Москва
Оптимизированы сочетания и концентрации регуляторов роста для индукции эмбриоидо- и каллусогенеза пеларгонии королевской (Pelargonium grandiflorum) в культуре пыльников и микроспор
Ключевые
слова: Pelargonium grandiflorum, пеларгония королевская,
культура микроспор, эмбриоидогенез, каллусогенез
Korchagin A.V.,
Polyakov A.V.
State Research
Institute of Vegetable Crops of Russian Academy of Agricultural Sciences,
Moscow
Optimize the combination and concentration of
growth regulators to induce callus formation and embryo- and callusogenesis royal P. grandiflorum in the culture of anthers and
microspores.
Keywords: Pelargonium grandiflorum, royal pelargonium, microspore culture, embryogenesis,
callusogenesis
Индукция прямого и непрямого (косвенного)
пути развития микроспор зависит от многих взаимосвязанных факторов, один из
важнейших – введение в состав питательной среды регуляторов роста [1,2]. Из литературных источников известно, что в культуре
in vitro у представителей рода Pelargonium для прямого эмбриоидогенеза рекомендуются сочетания регуляторов роста NАА + Kinetin [3,4] и 2,4-D и ВАР [7]; для индукции органогенеза на основе каллусов
- BAP, NАА, ТDZ [5,6,8]. Указанные сочетания регуляторов роста адаптированы к
регенерационным системам Pelargonium на
основе различных эксплантов в культуре ткани. В работах [9,10] описаны протоколы регенерации гаплоидных и диплоидных растений P.
zonale с использованием BAP, NАА, ТDZ. Для пеларгонии королевской (P. grandiflorum)
подобные исследования не известны.
Целью наших исследований являлось
разработка эффективной регенерационной системы для культуры пыльников и
микроспор пеларгонии королевской. В связи с эти были проведены эксперименты по
апробированию сочетаний и концентраций регуляторов роста.
Изолированные пыльники или суспензию
микроспор пеларгонии королевской помещали на среду МS, содержащую регуляторы
роста, сахарозу в концентрации 120 г/л и агар — 5 г/л (рН=5,8). Экспланты первые
двое суток выдерживали в темноте, затем культивировали при температуре 250С
и 16-тичасовом фотопериоде при освещенности 4000-5000 Лк. Через каждые семь
суток отмечали гибель или дальнейшее развитие эксплантов.
Регенерационная
система с использованием 2,4-D и BAP.
Изолированные пыльники пеларгонии королевской
сорта Петтикот культивировали на питательной среде MS, содержащей различные концентрации 2,4-D и BAP [по 7] всего 20 вариантов
(Таблица 1).
Таблица 1 - Регенерационная активность пыльников
пеларгонии королевской сорта Петтикот на
питательной среде MS, содержащей
различные концентрации 2,4-D и BAP на 21-е
сутки культивирования (n=50)
|
BAP
мг/л |
Вид регенерационной
активности |
|
||||
|
1,5 |
К |
К |
К |
Н |
Н |
|
|
1,0 |
К |
Э |
Э |
Э |
М |
р=0.05 |
|
0,5 |
К |
Э |
Э |
Э* |
М |
p<0.05 |
|
0,25 |
М |
Э |
Э |
Э* |
М |
p<0.05 |
|
0 |
Н |
М |
М |
М |
М |
|
|
|
0 |
0,25 |
0,5 |
1,0 |
1,5 |
2,4-D мг/л |
|
Примечание - Н - нет ответа;
М – эмбриогенные кластеры; Э – эмбриоиды; К – каллус; * - различия существенны при
p<0.05. |
||||||
Анализ регенерационной активности на 21-е
сутки культивирования показал, что наиболее приемлемыми вариантами для
получения эмбриоидов в культуре
пыльников являлись сочетания концентраций: (0,25…1,0) мг/л 2,4-D и (0,25…1,0) мг/л BAP. При этом,
статистически значимыми были различия в
комбинациях (0,25 мг/л 2,4-D
+ 1,0 мг/л BAP) и (0,5 мг/л 2,4-D
+ 1,0 мг/л BAP) (p<0.05). Концентрация 1,5 мг/л 2,4-D приводила к торможению эмбриогенного
ответа. В данном варианте регенерационная активность отсутствовала, либо
формировались эмбриогенные кластеры. При повторной пересадке эмбриоидов на
аналогичные среды, на 14-е –21-е сутки было отмечено замирание роста эмбриоидов
и эмбриогенных кластеров независимо от концентрации 2,4-D.
Таким образом, длительное культивирование эмбриоидов на среде с 2,4-D приводило к насыщению эмбриогенных клеток и, как
следствие, к торможению их роста и развития.
Регенерационная
система с использованием Kin и NАА
Культивирование пыльников пеларгонии
королевской сорта Петтикот
проводили на питательной среде MS, содержащей различные концентрации Kin
и NАА [по 3,4], всего 20 вариантов (Таблица
2).
Таблица 2 - Регенерационная активность пыльников пеларгонии королевской сорта Петтикот на питательной среде MS, содержащей различные концентрации Kin
и NАА на 21-е сутки
культивирования (n=50)
|
Kin, мг/л |
Вид регенерационной активности |
|
|||
|
3,0 |
К |
К |
К |
К |
|
|
2,5 |
М |
Э |
Э* |
К |
p<0.05 |
|
2,0 |
М |
Э |
Э* |
К |
p<0.05 |
|
1,5 |
М |
Э |
Э |
М |
р=0.05 |
|
1,0 |
М |
М |
М |
М |
|
|
0,5 |
М |
М |
М |
М |
|
|
0 |
Н |
Н |
Н |
Н |
|
|
|
0 |
0,05 |
0,1 |
0,5 |
NАА мг/л |
|
Примечание - Н- нет ответа; М
– эмбриогенные кластеры; Э – эмбриоиды; К – каллус; * - различия существенны при
p<0.05. |
|||||
Анализ регенерационной активности на 21-е
сутки культивирования показал, что наиболее приемлемыми вариантами для
получения эмбриоидов являлись сочетания
концентраций: (1,5…2,5) мг/л Kin и (0,05…0,1)
мг/л NАА. При этом,
статистически значимыми были различия в
комбинациях (2,0 мг/л Kin + 0,1 мг/л NАА) и (2,5 мг/л Kin + 0,1 мг/л NАА) (p<0.05). В случае
повышения в питательной среде концентрации
Kin до
3,0 мг/л на основе пыльников образовывались каллусы, т.е. клетки, возникающие в
результате деления, быстро увеличивались в размере и, разрывая оболочки
пыльцевого зерна, образовывали массу каллуса. Таким образом, «эмбриогенное окно» в рамках изучаемых
концентраций сочетания регуляторов роста «Kin и NАА» было достаточно узким - в интервале (2,0…2,5)
мг/л Kin. При увеличении концентраций Kin
наблюдалось образование каллуса, при снижении - формирование эмбриогенных кластеров,
что можно объяснить тем, что «низкие»
и «высокие» концентрации Kin были не подходящим для развития эмбриоидов.
Регенерационная
система с использованием BAP и NАА
Были проведены эксперименты по
культивированию пыльников пеларгонии королевской сортов Шоко,
Лотос, Петтикот и Априкотт на питательной среде MS, содержащей различные концентрации BAP и NАА [по 5,6,8], всего 20 вариантов (Таблица 3).
Таблица 3 - Регенерационная активность пыльников пеларгонии королевской сорта Петтикот на питательной среде MS, содержащей различные концентрации BAP и NАА на 21-е сутки культивирования (n=50)
|
BAP мг/л |
Вид регенерационной активности |
|
||||||
|
5,0 |
Н |
Н |
М |
М |
М |
Н |
Н |
|
|
4,0 |
К |
Э |
Э |
Э |
Э* |
Э |
М |
p<0.05 |
|
3,0 |
К |
Э |
Э |
Э |
Э* |
Э |
К |
p<0.05 |
|
2,5 |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
р=0.05 |
|
2,0 |
К |
К* |
К* |
К |
К |
К |
К |
p<0.05 |
|
1,0 |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
р=0.05 |
|
0,5 |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
К |
р>0.05 |
|
0 |
Н |
К |
К |
К |
К |
К |
Н |
|
|
|
0 |
0,05 |
0,1 |
0,2 |
0,3 |
0,4 |
0,5 |
NАА, мг/л |
|
Примечание - Н- нет ответа; М
– эмбриогенные кластеры; Э – эмбриоиды; К – каллус; * - различия существенны при
p<0.05. |
||||||||
Анализ регенерационной активности
пыльников на 21-е сутки культивирования показал, что в вариантах сред с содержанием ВАР 3,0 мг/л и
4,0 мг/л образовывались эмбриоиды. При этом, статистически значимыми были
различия в комбинациях: (4 мг/л BAP + 0,3 мг/л NАА) и (3
мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА) (p<0.05). Концентрации (1,5…2,5) мг/л ВАР и (0,05…0,5) мг/л NАА приводили к
образованию каллуса. При этом, в
комбинациях регуляторов роста (2,0 мг/л
ВАР + 0,05 мг/л NАА) и (2,0 мг/л ВАР + 0,1 мг/л NАА) различия по образованию каллуса носили статистически
значимый характер (p<0.05).
Таким образом, результаты
проведенных исследований показали, что
в культуре пыльников и микроспор пеларгонии королевской для индукции
прямого эмбриоидогенеза наиболее эффективным являлись сочетанием регуляторов
роста: (0,25 мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP); (0,5
мг/л 2,4-D + 1,0 мг/л BAP); (4 мг/л BAP + 0,3 мг/л NАА), а для индукции
каллусогенеза: (0,5 мг/л 2,4-D + 1,5 мг/л BAP); (3,0 мг/л Kin + 0,1 мг/л NАА); (2
мг/л BAP + 0,05 мг/л NАА); (2 мг/л BAP + 0,1 мг/л NАА).
Список использованных
источников
1.
Дьячук Т.И.
Цитологическое подтверждение спорофитного развития микроспор в культуре
пыльников тритикале без холодового воздействия /Т.И. Дьячук, О.В. Хомякова,
Т.О. Дугина //Сельскохозяйственная биология.-2010.- № 5.-С. 61-65.
2.
Зонтиков, Д.Н.
Температурный стресс повышает выход эмбриоидов капусты белокочанной в культуре
микроспор /А.В. Поляков, Д.Н. Зонтиков //Картофель и овощи.- 2009.- №7.- С.25.
3. Aboel-Nil M.M. Effect of
auxin-cytokinin interaction on organogenesis in haploid callus of pelargonium
hortorum /М.М. Aboel-Nil, А.С. Hildebrandt, R.F. Evert //In Vitro August.- 1976.-, V.12 (8) .-Р. 602-604.
5. Arshad M. Thidiazuron-induced shoot organogenesis from mature
leaf explants of scented Pelargonium capitatum cultivars /M. Arshad et al //Springer Verlag (Germany).-2012.-
P.315-322.
7.
Klaus-Thomas Haensch. Influence of 2,4-D and BAP on callus growth and the subsequent regeneration
of somatic embryos in long-term cultures of Pelargonium x domesticum
cv. Madame Layal //Electronic
Journal of Biotechnology.-2007-Vol.10.-No.
(Jan 15).-Р.1-9
8. Li, Ming-Yin.
Observation of High-Frequency Occurrence of Chimeral Adventitious Shoots in Tissue
Culture from the Chimeral Tissues of Pelargonium
zonale. HortScience.-2005.- V.40 (5).-P.1461-1463.
9. Monika Tuleja,
Aleksandra Krupa, Grzegorz Góralski, Bartosz J. Płachno. Morphological and histological events in the preliminary tissue culture of haploid and diploid pelargonium zonale
var . «Kleiner libeling» //Modern
Phytomorphology.-2014.-V.6.-P. 39–40.
10.
Wojtania A. Regeneration of Pelargonium x hederaefolium
"Bonete" from petiole explants /A. Wojtania; E. Gabryszewska; A.
Marasek //Acta Physiol.Plantarum.-2004.- Vol. 26, N 3.-4p.