Лахтин М.В., Лахтин В.М., Афанасьев С.С.

Московский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

АЦИЛАКТ - МУЛЬТИШТАММОВАЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ

СИСТЕМА ДЕГРАДАЦИИ И ЦИТОЛИЗА

Резюме. Результаты перспективны для контроля и конструирования консорциумов.    

      Ключевые слова: лактобациллы, бифидобактерии, консорциумы, культуры, среды.

Summary. Acilact - multistrain antagonistic system possessing degradation and cytolytic potential. Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Afanasiev S.S., Aleshkin V.A. Moscow Research Institute for Epidemiology & Microbiology after G.N. Gabrichevsky, Russia. Results are perspective for control of and constructing interspecies consortia.  

      Key words: lactobacilli, bifidobacteria, consortia, Gram-positive bacteria, cultures, media.

Введение. Деградация и лизис микроорганизмов – важные факторы внутримикробиоценозных взаимоотношений. Мультиштаммовый консорциум Ацилакт обладает повышенным антимикробнымм потенциалом и может служить моделью взаимоотношений в микробиоценозе. Целью было исследовать факторы деградации и цитолиза консорциумных культур грамположительных бактерий на примере Ацилакта.

Материалы и методы. Использовали штаммы L.helveticus NK1, L.helveticus 100аш  и L.casei К3III24  - ингредиенты Ацилакта; штаммы B.adolescentis spp. longum МС42, B.gallinarum ГБ, B.breve 23, B.longum B379M, B.infantis 302-87 - из коллекции микроорганизмов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Концентраты и фракции компонентов (> 27 кД) культур, выращенных в Бифидум-среде или среде КД-5с 18-24 ч при 37оС, оценивали изоэлектрофокусированиtv в полиакриламидном геле (ИЭФ-ПААГ) с последующим блотингом на мембрану и проявлением  красителем SYPRO Ruby protein blot stain (Bio-Rad) или меченым биотином ПАА-гликоконъюгатом и затем – Стрептавидин-пероксидазой в присутствии хемилюминесцентного субстрата пероксидазы BioWest (Pierce, США). Кинетику свечения регистрировали в системе BioChemi System (UVP Bioimagination, Calif.). Проводили оценку параметров культуральной жидкости (КЖ) и фракций методом ранжирования, а также оценку гидролазной и оксидоредуктазной систем [1-3]. Регистрирровали градиент изменения кинетической пероксидазной хемилюминесценции: каскадного превращения инициаторной точки/ пятна (близкой к области pI 5.5) в направлении более кислых полос (снижения pI в треке в направлении области pI 5.1) с формированием конечного дискретного имэджа обесцвечивания на блоте. Для регистрации белкового свечения блот обезжиривали 10% метанолом в растворе 7% уксусной кислоты рН 2.5 и затем обрабатывали (псевдополисахарид-биотин)-(стрептавидин-пероксидазой) с последующей регистрации реакции при 50-60оС.

Результаты. 1. Ацилакт – антагонистическая мультикультура. Виды  L.casei и L.helveticus были противопоставлены (в том числе антагонистичны) друг другу в Ацилакте по таким параметрам, как  содержание частично гидролизованного белка, выраженность кислых белков с pI 4-5, выраженность альфа/ бета-казеиназ, способность к мембранной ультрафильтрации высокомолекулярных концентратов и их склонность к агрегации при хранении, выраженность активных против минерального масла биосурфактантов, выраженность продуктов Майларда, абсолютное содержание Ala (в том числе из состава пептидогликанаов клеточной стенки, сайты для эндо- и экзопептидаз), содержание Val (участие в биосинтезе летучих жирных кислот), содержание Asp/Asn (участки гликозилирования белков и сайты для амидаз), сравнительное низкое содержание Pro  (участие в Pro-изгибах регулярной структуры в белках). Штамм К3III24 , в свою очередь, противопоставлялся прочим штаммам-ингредиентам Ацилакта присутствием катионных высокопроницаемых пептидных комплексов, способностью деградировать (глико)протеины в слабокислой  pI-области, активностью против грамположительных бактерий.

2. Оксидоредуктазная обесцвечивающая краситель система - индикаторная, диагностическая и высокочувствительная в отношении установления цитолиза культур штаммов-ингредиентов и мультипробиотика. Сорбированная на мембране обесцвечивающая краситель активность (ОКА) лактобацилл была сходна с активностью термостабильной при 60оС и щелочной при рН 8 (рН 8,5 в случае субстрата BioWest)  каталазы-пероксидазы Bacillus sp. [4]. Ацилакт характеризовался максимально выраженным компактным диапазоном ОКА (максимальным числом ее изоформ рI 5.1-5.5), а 100аш являлся доминирующим вкладчиком в ОКА Ацилакта. ОКА отсутствовала у NK1. К3III24 являлся вкладчиком более кислых (ближе к pI 5.5) форм ОКА Ацилакта (исходя из аддитивности ОКА ингредиентных штаммов в ОКА консорциума). В одном из случаев бифидобактерий выявлялась слабо выраженная (точечно-спотовая, с pI в слабокислой области) ОКА (у штамма МС-42, на фоне полного отсутствия у штамма № 1).

Выводы: 1. Выраженными факторами деградации и цитолиза мультиштаммового консорциума являются: инициирующий дальнейший цитолиз консорциума вклад цитолизной культуры ингредиентного штамма (штаммов); конкурентный антагонизм противопоставленных в микробиоценозе лидерных видов и штаммов; деградационный потенциал гидролаз, оксидоредуктаз, деполимераз и гликоконъюгаты-ассоциированных комплексов. 2. Индикаторными признаками деградационного и цитолизного состояния/ статуса консорциума могут служить оксидоредуктазные и протеазные системы штаммов-ингредиентов. 3. Оксидоредуктазный имэджевый паттерн выявляет каскадность форм оксидоредуктазной системы, служит индикатором цитолиза. 4. Стратегией направленного повышения антимикробного потенциала консорциума может служить управляемые деградационные и цитолизные процессы мультикультуры. 5. В случае управляемого цитолиза становятся обоснованными перспективы создания безклеточных (мульти)про/синбиотиков объединением супернатантов КЖ штаммов-ингредиентов. 6. Перспективно получение очищенных кофункционирующих каскадных систем - иммобилизованных оксидоредуктазных мембранных термостабильных биокатализаторов мультипробиотической природы.

Заключение. В целом, результаты перспективны для конструирования межвидовых консорциумов и мультиштаммовых про/синбиотиков с повышенной направленной антимикробной активностью.

Литература:

1. Лахтин В.М., Лахтин М.В., Агапова Ю.В., Беликова Е.В., Кулакова Ю.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Преимущества пробиотического консорциума «Ацилакт» в сравнении с ингредиентными штаммами с использованием алгоритма ранжирования качеств // Научное пространство Европы-2012: сб. материалов  международной НПК (7-15 апреля, 2012, Польша). Серия Биологические науки. - Том 32. – С. 50-57 (Materiały VIII Międzynarodowej naukowi-praktycznej konferencji «Naukowa przestrzeń Europy - 2012» Vol. 32. – P. 50-57. Nauk biologicznych.: Przemyśl. Nauka i studia]. ISBN 978-966-8736-05-6). DOI link: http://doi.org/10.17686/sced_rusnauka_2012-1309 , DOI: 10.17686/sced_rusnauka_2012-1309.

2. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Высокочувствительное выявление системных протеаз в культуральных жидкостях грамположительных бактерий, в том числе мультиштаммового консорциума // Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологий : IV Международная научная Интернет-конференция : материалы конф. (Казань, 16-17 октября 2013 г.) : в 2 т. / Сервис виртуальных конференций Pax Grid ; сост. Синяев Д. Н. - Казань : ИП Синяев Д. Н. , 2013.- Т. 1. – С. 167-172.- ISBN 978-5-906217-32-5. http://elibrary.ru/item.asp?id=21237221

3. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин А.В., Афанасьев С.С., Корсун В.Ф. Оксидазы-содержащие и гликоконъюгаты-связывающие системы в фитопрепаратах: идентифицированные, очищенные, разделенные и иммобилизованные активные сенсорные формы по данным хемилюминесценции в режиме реального времени // Практическая фитотерапия. – 2013. - № 4. – С. 4-9.

4. Paar A., Raninger A., de Sousa F., Beurer I., Cavaco-Paulo A., Gubitz G.M.  Production of catalase-peroxidase and continuous degradation of H2O2 by an immobilized alkalothermophilic  Bacillus sp. // Food Technol. and Biotechnol.- 2003.- V.41. - P.101-104.