Медицина/ 6

Медицина/ 6. Экспериментальная и клиническая фармакология

д.м.н. Ступин В.А., д.м.н. Силина Е.В., к.м.н. Орлова А.С.

ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, г. Москва

ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, г. Москва

Разработка экспериментального протокола доклинических испытаний имплантируемых датчиков артериального давления на животных

Введение.

Внедрение в клиническую практику новых диагностических и лечебных устройств требует проведения доклинических испытаний, объем и сложность которых определяется техническими возможностями исследуемого устройства [Босхомджиев А.П., 2010, Шкодкин С.В., Иванов С.В., Идашкин Ю.Б., 2012, Cleven NJ, Isfort P, Penzkofer T, 2014].

Исследования на различных животных моделях позволяют оценить токсичность, биологическую совместимость исследуемого устройства, а также эффективность его работы при различных патологических состояниях, что в дальнейшем дает возможность интерпретировать полученные результаты на человека [Gallego L, Soro M, Alvariño A, 2015, Lu HY, Dong F, Liu CY, 2015].

Основными этапами данных исследований являются оценка физико-химических свойств устройства и их покрытия, которые проводятся ex vivo и in vitro. В дальнейшем в зависимости от цели использования устройства проводятся исследования in vivo при нормальном состоянии организма животного и с моделированием различных патологических состояний [Севастьянова В.В., Елгудин Я.А., Глушкова Т.В., 2015, Cleven NJ, Müntjes JA, Fassbender H, 2012].

Изучение гема- и биосовместимости – затратное и трудоемкое исследование, требующее специального оборудования. В то же время проведение таких испытаний в комплексе с лабораторной, гистологической и микроскопической оценкой позволяет максимально точно судить об инертности длительно имплантируемых устройств.

Цель: разработка экспериментального протокола доклинических испытаний имплантируемых датчиков артериального давления на животных.

Протокол доклинических испытаний

Исследование будет проведено соответственно стандартам требования Правил лабораторной практики в РФ (Приказ МЗ РФ №267 от 19.06.03). Условия содержания животных будут соответствовать международным стандартам руководства The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (ILAR, 1996, National Academy Press, 1996).

Проведение экспериментального исследования будет разработано на основании ГОСТа Р ISO 10993-4-2009 для исследования изделий, взаимодействующих с кровью. Согласно ISO 10993-1 разработанный датчик относится к категории имплантируемые изделия.

Первым этапом исследования устройств, контактирующих с кровью, будет оценка гемосовместимости. Далее будет проведена серия экспериментов на животных моделях для оценки биосовместимости исследуемого устройства, возможности его имплантации в и на артерию и эффективности его работы, как в здоровом организме, так и при различных патологических состояниях (ишемия, гипертензия).

Проведенный анализ литературы показал, что для покрытия исследуемых датчиков целесообразно использовать силикон, в связи с тем, что его свойства широко изучены и данное покрытие обладает высокой биосовместимостью и используется в устройствах, контактирующих с кровью.

Для оценки биосовместимости будут проведены эксперименты на маленьких животных моделях, а для оценки работы датчика он будет установлен крупным животным с последующим моделированием различных сердечно-сосудистых катастроф.

Для оценки гемосовместимости в исследовании in vitro будет проведена оценка адгезии тромбоцитов на исследуемом датчике. Данный тест рекомендован ISO 10993-4:2009 для оценки любых медицинских устройств, контактирующих с кровью. О гемосовместимости исследуемых образцов будет свидетельствовать отсутствие измененных, распластанных форм клеток.

Имплантация части прототипа датчика в брюшную часть аорты, подкожно, внутримышечно и в печень крыс

Оценки биосовместимости датчика (часть его материала с/без покрытия) будет проведена на 120 крысах линии Wistar. Методом рандомизации животные будут разделены на группы (табл. 1). Основным критерием будет являться масса тела, показатели которой не должны будут отклоняться от среднего значения более, чем на 20%. Для идентификации животных на ушной раковине будет сделан прокол, на котором будет фиксироваться карточка с индивидуальным номером.

Для введения в наркоз исследуемым животным будет проведена в/м инъекция смеси золетина 50 (10 мг/кг и 6 мг/кг для крыс и кроликов соответственно) и ромпуна 2% (0,05 мг/кг для крыс и кроликов) (ксилазин гидрохлорид).

Как до, так и после оперативного вмешательства животным будет проводиться клинический осмотр, результаты которого будут фиксироваться в соответствующей анкете. Будут проанализированы такие показатели как поза, поведение, внешний вид, состояние шерсти, общая подвижность, рефлексы (реакция на человека, на резкий звук, болевой ответ и зрачковый рефлекс).

Таблица 1. Распределение животных для проведения оценки биосовместимости

Группы		Период наблюдения
Группы		7-е сутки	14-е сутки	21-е сутки	30-е сутки	60-е сутки	90-е сутки	120-е сутки	180-е сутки
Группа 1	Датчик без покрытия n=40	n=35	n=30	n=25	n=20	n=15	n=10	n=5	-
Группа 1	Число имплант. датчиков n=200	n=175	n=150	n=125	n=100	n=75	n=50	n=25	-
Группа 2	Датчик c силиконовым покрытием 1 слой n=40	n=35	n=30	n=25	n=20	n=15	n=10	n=5	-
Группа 2	Число имплант. датчиков n=200	n=175	n=150	n=125	n=100	n=75	n=50	n=25	-
Группа 3	Датчик c силиконовым покрытием 3 слоя n=40	n=35	n=30	n=25	n=20	n=15	n=10	n=5	-
Группа 3	Число имплант.датчиков n=200	n=175	n=150	n=125	n=100	n=75	n=50	n=25	-

Прототип устройства (или часть его материала) диаметром до 2 мм (без покрытия, с силиконовым покрытием (1 и 3 слоя) будет имплантирован в и на брюшную часть аорты. Для этого животным будет проведена внутрибрюшинная инъекция тиопентала натрия 40 мг/кг для введения в наркоз с дальнейшим использованием ингаляционного наркоза с использованием 1% изофлурана. Животным будет проведена срединная лапаратомия и открыто забрюшинное пространство, после чего будет выделен участок аорты между почечными и подвздошными артериями. Далее стенка аорты будет проколота, а в отверстие введен прототип датчика (без покрытия и с силиконовым покрытием (1и 3 слоя), который будет продвижен вглубь аорты на 1-1,5 см. Между датчиком и стенкой аорты будет помещена прокладка из целлюлозной ткани. В место прокола стенки аорты будет нанесен медицинский цианакрилатный клей типа МК-2. Далее будет проведена фиксация датчика на сосуд крысы и в печень.

Для подкожной имплантации датчика животные будут помещены в положение на груди и стерильные исследуемые датчики (без покрытия и с силиконовым покрытием (1 и 3 слоя) будут введены подкожно и внутримышечно. Будут оценены такие показатели как тканевая реакция и время образования соединительной ткани в области имплантации эндопротезов.

О наличии болевой реакции после операции будет свидетельствовать пассивность животных и отказ от пищи и воды. В таком случае им будет проведено дополнительное обезболивание.

В течение 6 месяцев после имплантации животные будет содержаться в стандартных условиях без антибиотикотерапии для оценки их биосовместимость (воспалительный ответ и состав соединительной ткани).

Животные будут выводиться из эксперимента на 7-е, 14-е, 30-е, 90-е, 120-е и 180-е сутки методом декапитации с последующим вскрытием и извлечением необходимого для исследования материала (кожа-датчик, мышцы-датчик, окружающие ткани, аорта-датчик, печень-датчик), ткань будет иссечена ножницами с острыми браншами, превышая необходимый размер на 1-2 мм во всех направлениях. Полученный материал будет помещен в 4% формалин и залит парафином по стандартной методике. Планируется получить 600 макропрепаратов, из которых будет сделано 1800 серийных срезов толщиной 5-6 микрон. После этого срезы будут окрашены гематоксилином-эозином и изучены при помощи светооптического микроскопа “Leica”.

Оценка биоактивности устройства (без покрытия, с силиконовым покрытием (1 и 3 слоя) будет проводиться по 11 морфологическим признакам тканевой реакции (нейтрофильная инфильтрация, макрофаги на границе имплантата, макрофаги в капсуле, включение пигментов (например, железа) в макрофагах, гигантские клетки, лимфоцитарная инфильтрация, плазматические клетки, дистрофия фибробластов, коллагеновых волокон, плотность фибробластов и коллагеновых волокон на единицу площади) на имплантацию по 5-ти балльной системе от 0 (отсутствие признака) до 4 (признак максимально выражен). Чем меньше индекс, тем больше биоинертность материала.

Следующим этапом оценки эффективности и безопасности работы устройства in vivo и оценки сигнала планируется изучать на более крупных моделях животных с моделированием сердечно-сосудистых заболеваний.

Заключение

Таким образом, был разработан экспериментальный протокол доклинических испытаний имплантируемых датчиков артериального давления на животных, проведение которого позволит приступить к клиническим испытаниям разработанного устройства. Внедрение дистанционных систем мониторирования сердечно-сосудистой системы позволит осуществлять непрерывный контроль различных функциональных параметров сердца, что позволит оптимизировать лечение пациентов с различными сердечно-сосудистыми заболеваниями.

Благодарности. Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ, проект № 13-04-12087).

Список литературы

1. Босхомджиев А.П. Изучение биодеструкции и биосовместимости полимерных систем на основе полиоксиалканоатов. автореф. дис. к.б.н. – 2010. – С. 1-28.

2. Севастьянова В.В., Елгудин Я.А., Глушкова Т.В. и др. Использование протезов из поликапролактона для сосудов малого диаметра. Ангиология и сосудистая хирургия. - 2015. - Т. 21. № 1. - С. 44-53.

3. Шкодкин С.В., Иванов С.В., Идашкин Ю.Б., Фентисов В.В. Экспериментальное исследование биоинертности материалов, используемых в производстве хирургческих стентов. Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье". – 2012. - № 4. – С. 32-39.

4. Cleven NJ, Isfort P, Penzkofer T et al. Wireless blood pressure monitoring with a novel implantable device: long-term in vivo results. Cardiovasc Intervent Radiol. – 2014. - №37(6).- Р.1580-1588.

5. Cleven NJ, Müntjes JA, Fassbender H et al. A novel fully implantable wireless sensor system for monitoring hypertension patients. IEEE Trans Biomed Eng. – 2012. - №59(11). – Р.3124-3130.

6. Gallego L, Soro M, Alvariño A et al. Renal and hepatic integrity in long-term sevoflurane sedation using the anesthetic conserving device: a comparison with intravenous propofol sedation in an animal model. Rev Esp Anestesiol Reanim. – 2015. - №62(4). –Р.191-203.

7. Lu HY, Dong F, Liu CY et al. An animal model of obstructive sleep apnoea-hypopnea syndrome corrected by mandibular advancement device. Eur J Orthod. -2015. - №37(3).- Р.284-289.