Кучеренко В.П., Жуков В.І., Артюгіна Л.І.

Харківський національний медичний університет (м. Харків)

ОСОБЛИВОСТІ ЕНЕРГЕТИЧНОГО ОБМІНУ В ГЕПАТОЦИТАХ ПІД ВПЛИВОМ СУБТОКСИЧНИХ ДОЗ ПОЛІОКСИПРОПІЛЕНГЛІКОЛЮ МОЛЕКУЛЯРНОЇ МАСИ 2100

Вступ

Значне антропогенне хімічне навантаження на навколишнє середовище призводить до підвищення захворюваності населення та розвитку екологічної патології [1–5]. Несприятлива та тривала дія незначних концентрацій хімічних сполук на організм визначає скриті періоди розвитку патологічних станів, які в більшості випадків не діагностуються [1]. Проте, у розумінні механізмів формування донозологічних станів необхідним є комплексне вивчення патогенезу пошкоджуючої дії ксенобіотиків на різні органи, системи і функції організму [2]. Відомо, що метаболічні перетворення хімічних сполук екзогенного походження супроводжуються утворенням електрофільних метаболітів, які суттєво можуть відрізнятися за біологічною активністю від своїх попередників та характеризуватися можливістю формування віддалених наслідків [3]. Процес накопичення реактивних хімічних метаболітів в організмі, як правило, протікає на тлі дисфункції гіпоталамо-гіпофізарно-надниркової системи. Поряд з цим необхідно відмітити, що в подальшому ксенобіотики при тривалому надходженні до організму здатні порушувати метаболізм та енергетику клітин, ковалентно зв’язуватися з макромолекулами – білками й нуклеїновими кислотами, формувати мембранопошкоджуючі ефекти [4]. При цьому, на перше місце можуть виступати показники функціонального стану мікросом, мітохондрій та інших внутрішньоклітинних структурних одиниць, які безпосередньо приймають участь у знешкодженні реактивних метаболітів і ксенобіотиків [1, 2]. Окрім цього, не виключена можливість утворення більш токсичних і біологічно активних продуктів метаболізму, особливо в умовах попередньої індукції такими факторами, як паління, алкоголізм, фармакологічні препарати тощо [1, 3, 4]. Доведено, що активація системи метаболізму ксенобіотиків може призвести до модифікації специфічного ефекту, що обумовлює утворення канцерогенів і мутагенів [3, 4]. Усе вищенаведене обумовлює необхідність вивчення патохімічних механізмів розвитку структурно-метаболічних розладів, які формуються під впливом хімічних сполук антропогенного походження в субтоксичних дозах.

Метою роботи було дослідження впливу поліоксипропіленгліколю молекулярної маси 2100 на метаболічну активність мітохондрій та енергетичний обмін гепатоцитів за умов тривалої субтоксичної дії на щурів.

Матеріали та методи дослідження

У роботі вивчався поліоксипропіленгліколь молекулярної маси 2100, що має технічну назву «Лапроли» (Лп-2102), з регламентованими фізико-хімічними властивостями, який широко застосовується в різних галузях народного господарства для виробництва штучної шкіри, поліуретанів, пінопластів, пластмас, епоксидних смол, лаків тощо [2, 3]. На основі результатів гострої токсичності Лп-2102 відноситься до помірно токсичних сполук (ІІІ клас безпеки), середньолетальна доза (ДЛ₅₀) становить 1,45 г/кг маси щурів [3, 4]. Програма дослідження передбачала проведення підгострого тривалого (60 діб) субтоксичного експерименту, в якому щури популяції Вістар щоденно отримували пероральним шляхом Лп-2102 у дозах 1/10, 1/100 і 1/1000 ДЛ₅₀. Лп-2102 у вигляді водних розчинів вводився за допомогою металевого зонда внутрішньошлунково вранці натщесерце. Контрольна група тварин отримувала відповідні об’єми питної води. У кожній експериментальній групі було по 10 щурів. Експерименти виконувалися згідно сучасних принципів біоетики. Після завершення тривалої токсифікації тварин вивчали метаболічну активність мітохондрій гепатоцитів та їх енергетичний обмін, використовуючи загальноприйняті методики. Оцінку метаболічного стану (дихання) мітохондрій визначали полярографічним методом з використанням платинового електрода Кларка [6]. Оцінювали параметри окислювального фосфорилування за Чансом: V-2 - швидкість поглинання кисню після додавання субстрату, V-3 - швидкість поглинання кисню у присутності акцептора АДФ, V-4 - швидкість поглинання кисню у безакцепторному середовищі та у присутності роз'єднувача 2,4-динітрофенолу – V-4р. Розраховували коефіцієнт фосфорилування (АДФ/О₂), який характеризує спряженість процесів окислення та фосфорилування у дихальному ланцюзі; дихальний коефіцієнт Ларді – співвідношення швидкості поглинання кисню у стані V-3 до швидкості поглинання кисню у стані V-4. Як субстрат окислення використовували сукцинат. Активність Са²⁺, Mg²⁺-залежної АТФази в мітохондріях гепатоцитів визначали загальноприйнятим методом [7]. Вміст АТФ у тканинах печінки вивчали за методом Е. Beutler [8], АДФ – за методом D. Jaworek et al. [9], креатинфосфату – за методом E.Ф. Coніна [10] і неорганічного фосфору – за методом, що описаний Н.П. Мешковою та C.Є. Севериним [7]. Величину значення енергетичного потенціалу (ЕП) розраховували за формулою Д.Е. Atrinson [11]. Вміст циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) і циклічного гуанозинмонофосфату (цГМФ) визначали в печінці за методом А.L. Steiner et al. [12]. Отримані результати опрацьовувалися методами варіаційної статистики з використанням критерію Стьюдента-Фішера.

Результати дослідження та їх обговорення

Вивчення метаболічної активності мітохондрії гепатоцитів після 60-добової токсифікації щурів субтоксичними дозами виявило пригнічення дихання мітохондрій в безакцепторному середовищі (V-4) на 53,2 і 46,2% відповідно під впливом Лп-2102 у дозах 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ (табл. 1). Ці дані вказують на зниження долі фосфорилюючого та підвищення інтенсивності вільного дихання, що підтверджується також зниженням інтенсивності дихання в третьому (V-3) метаболічному стані після внесення акцептора АДФ. Дослідження показали, що в метаболічному стані V-3, інтенсивність дихання мітохондрій після додавання АДФ знижувалася порівняно з контролем на 62,6 і 41,5% відповідно в групах щурів, токсифікованих 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀. Дихальний коефіцієнт Ларді в цих умовах під впливом 1/10 ДЛ₅₀ знижувався на 12,9% та підвищувався на 9,3% в групі тварин, токсифікованих 1/100 ДЛ₅₀. При цьому, коефіцієнт фосфорилювання знижувався на 50,2 і 28,9% під впливом 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ відповідно. Оцінка інтенсивності дихання мітохондрій після вичерпання АДФ і внесення роз’єднувача 2,4-ДНФ виявила його пригнічення на 49,3 і 41,5% під впливом 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ відповідно. У той же час, аналіз активності АТФ-гідролазних реакцій показав, що Лп-2102 як в 1/10 ДЛ₅₀, так і в 1/100 ДЛ₅₀ суттєво пригнічує метаболічну активність мітохондрій, знижує інтенсивність реакцій окислювального фосфорилювання і синтез АТФ, що може бути поєднано з порушенням структури мітохондрій та роз’єднанням дихання і

Таблиця 1

Метаболічна активність мітохондрій гепатоцитів у щурів під впливом субтоксичних доз Лп-2102 на 60-ту добу експерименту

Показники	Контроль (n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
V-4, нмоль О2/хв·мг білка	2,86±0,17	1,34±0,07*	1,54±0,13*	2,12±0,20
V-3, нмоль О2/хв·мг білка	6,20±0,48	2,52±0,24*	3,63±0,27*	4,55±0,56
2,4-ДНФ (V-4р), нмоль О2/хв·мг білка	7,31±0,56	3,71±0,42*	4,28±0,36*	6,98±0,63
ДК, (V-3/V-4), відн. од.	2,16±0,36	1,88±0,24*	2,36±0,27*	2,14±0,32
АДФ/O2, відн. од.	2,73±0,25	1,36±0,16*	1,94±0,18*	2,84±0,27
Mg^2+-АТФаза, мкмоль Р/мг білка·год	76,4±4,17	52,30±4,15*	64,25±4,10*	75,43±5,18
Са^2+-АТФаза, мкмоль Р/мг білка·год	72,8±4,65	46,14±3,62*	57,36±4,15*	73,65±4,10
Н^+-АТФаза, мкмоль Р/мг білка·год	73,6±3,88	45,86±3,75*	53,62±3,75*	74,23±4,76

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

фосфорилювання. У основі провідних ланцюгів структурно-метаболічних порушень у мітохондріях може бути пригнічення під впливом Лп-2102 активності сукцинатдегідрогенази, на що вказують дослідження інтенсивності дихання мітохондрій після внесення субстрату окислення – сукцинату (V-4).

Наведені дані про порушення метаболічної активності мітохондрій та особливо АТФ-гідролізних реакцій добре узгоджуються з результатами дослідження активності їх АТФаз (табл. 1). Так, дослідження показали зниження активності Mg²⁺-АТФази мітохондрій на 29,9 і 15,0%, Са²⁺-АТФази – на 36,6 і 21,2%, Н⁺-АТФази – на 34,0 і 27,2% відповідно в умовах субтоксичної дії Лп-2102 в 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀. Аналіз показує, що зниження активності ферментів може бути наслідком розвитку хронічної гіпоксії й структурно-метаболічних порушень, які виникли внаслідок тривалої дії на організм Лп-2102 в субтоксичних дозах. Відомо, що пригнічення активності даних ферментів тісно поєднано з механізмами окислення та фосфорилювання, що підтверджує їх роз’єднання та, як наслідок, – пригнічення енергопродукції. Однією з причин роз’єднання окислення і фосфорилювання в мітохондріях гепатоцитів при токсифікації може бути накопичення в них іонів кальцію, які гальмують синтез АТФ. Підвищення вмісту іонів кальцію в мітохондріях є енергозалежним активним процесом, який протікає проти градієнта концентрації та здійснюється за рахунок транспорту електронів у дихальному ланцюзі. Тому, у даному випадку при дії субтоксичних доз Лп-2102, можливо, вся енергія дихання буде витрачатися головним чином на транспорт кальцію, а не на фосфорилювання АДФ, тобто роз’єднання дихання й фосфорилювання.

Аналіз енергетичного обміну в печінці під впливом субтоксичних доз Лп-2102 показав, що на 60-ту добу експерименту (табл. 2) рівень АТФ знижувався на 70,1 і 57,3%, АДФ – на 59,5 і 46,0% на тлі підвищення АМФ на 96,5 і 55,3%, а неорганічного фосфату – на 112,5 і 73,1% відповідно в групах тварин, токсифікованих 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀. Ці дані добре узгоджуються з результатами дослідження метаболічної активності мітохондрій (табл. 1). Оцінка рівнів внутрішньоклітинних посередників виявила зниження вмісту цАМФ під впливом 1/10 ДЛ₅₀ на 29,4% та його підвищення на 24,2% в групі тварин, токсифікованих 1/100 ДЛ₅₀. Динамічні зміни рівня цГМФ мали протилежну спрямованість по відношенню до цАМФ: в 1/10 ДЛ₅₀ спостерігалося підвищення вмісту на 85,2%, а в 1/100 ДЛ₅₀ – його зниження на 26,3%. Дослідження показників медіаторного обміну свідчать, що Лп-2102 в 1/10 ДЛ₅₀ значно пригнічує внутрішньоклітинний обмін, тоді як в 1/100 ДЛ₅₀ – активує ці процеси, що вказує на суттєве напруження захисно-пристосувальних механізмів, спрямованих на забезпечення гомеостатичної функції організму. Сумарний вміст аденінових нуклеотидів був зниженим на 34,7 і 32,2% відповідно під впливом 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀. Рівень креатинфосфату, як макроергічного субстрату, у групі тварин, токсифікованих 1/10 ДЛ₅₀, знижувався, а під впливом 1/100 ДЛ₅₀ – підвищувався, що в комплексі дає змогу судити про те, що в меншій дозі Лп-2102 стимулює енергетичні процеси, тоді як при дії 1/10 ДЛ₅₀ вони значно пригнічені й віддзеркалюють зрив захисно-пристосувальних механізмів. Розрахунок енергетичного потенціалу виявив його пригнічення в 1/10 ДЛ₅₀ на 37,5%, а в 1/100 ДЛ₅₀ – на 33,5% (табл. 2).

Таблиця 2

Стан енергетичного обміну в печінці під впливом Лп-2102

в умовах субтоксичної дії на 60-ту добу експерименту

Показники	Контроль (n=10)	1/10 (n=10)	1/100 (n=10)	1/1000 (n=10)
АТФ, мкмоль/г	2,27±0,18	0,68±0,05*	0,97±0,08*	2,35±0,22
АДФ, мкмоль/г	1,26±0,08	0,51±0,03*	0,68±0,05*	1,24±0,09
АМФ, мкмоль/г	0,85±0,06	1,67±0,14*	1,52±0,11*	0,93±0,07
Неорганічний фосфор, мкмоль/г	4,95±0,53	10,52±0,95*	8,57±0,76*	5,12±0,48
цАМФ, нмоль/г	640,8±31,5	452,6±17,4*	795,4±41,6*	660,3±27,4
цГМФ, нмоль/г	42,3±3,46	78,34±5,26*	31,18±2,43*	44,56±3,75
Аденінові нуклеотид, мкмоль/г	4,38±0,106	2,86±0,07*	2,97±0,08*	4,52±0,126
Креатинфосфат, мкмоль/г	1,35±0,11	0,77±0,05*	1,83±0,11*	1,46±0,13
Енергетичний потен-ціал: АТФ+1/2АДФ АТФ+АДФ+АМФ	0,662±0,08	0,414±0,06*	0,44±0,03*	0,58±0,06

Примітка: * - р<0,05 відносно контролю

Таким чином, дослідження свідчать, що Лп-2102 під впливом 1/10 і 1/100 ДЛ₅₀ в умовах тривалої підгострої токсифікації здатний пригнічувати метаболічну активність мітохондрій, що супроводжується роз’єднанням дихання і фосфорилювання. Провідними ланцюгами мітохондріальної дисфункції гепатоцитів можуть бути інгібіція сукцинатдегідрогенази, накопичення іонів кальцію, активація вільнорадикальних процесів і перекисного окислення ліпідів, які супроводжуються мембранною патологією, зниженням синтезу макроергічних сполук і порушенням внутрішньоклітинного метаболізму. Аналіз результатів свідчить, що Лп-2102 у дозі 1/10 ДЛ₅₀ призводить при тривалій токсифікації до розвитку гіпоксії та зриву захисно-пристосувальних механізмів, тоді як у дозі 1/10 ДЛ₅₀ – до активації процесів, спрямованих на забезпечення гомеостатичної функції організму. У дозі 1/1000 ДЛ₅₀ Лп-2102 при тривалій токсифікації не впливає на метаболічний стан мітохондрій та енергетичні процеси гепатоцитів.

Література

1. Биохимические аспекты экологической патологии, связанные с химическим загрязнением поверхностных источников водоснабжения / [Щербань Н.Г., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Резуненко Ю.К. ]. – Харьков: «Раритеты Украины», 2011. – 176 с.

2. Медико-биологические аспекты проблемы охраны водных объектов от загрязнения поверхностно-активными веществами / [В.И. Жуков, Р.И. Кратенко, Ю.К. Резуненко и др.]. – Харьков, «Торнадо». – 2000. – 394 с.

3. Биологическая активность детергентов – производных нонилбензолов в связи с проблемой охраны водных объектов / В.И. Жуков, С.А. Стеценко, В.И. Пивень и др.]. – Белгород: «Белвитамины», 2000. – 237 с.

4. Эколого-гигиеническая характеристика азотсодержащих поверхностно-активных веществ как загрязнителей водоемов / В.И. Жуков, В.В. Мясоедов, С.А. Стеценко и др]. – Харьков: «Торнадо», 2000. – 180 с.

5. Эколого-гигиеническая характеристика детергентов на основе алкилфенолов, изозонилфенолов и вторичных спиртовых фракций С_10-20, как загрязнителей водоемов / А.Я. Цыганенко, Л.Г. Шаповал, В.Н. Зовский и др.]. – Белгород: «Белвитамины», 2000. – 170 с.

6. Chance B. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation J. kinetics of oxyden unilization / B. Chance, G.R. Williams // J. Biol. Chem. – 1955. – Vol. 217, № 1. – P. 383–395.

7. Мешкова Н.П. Практикум по биохимии / Н.П. Мешкова, С.Е. Северин. – М.: МГУ, 1979. – 428 c.

8. Beutler E. Method of enzymatic analysis / E. Beutler // New York. – 1975. – Vol. 1, № 3. – P. 565–566.

9. Joworek D. Adenosin-5-diphosphate and Adenosin-5-monophosphate / D. Joworek, W. Gruber, H.U. Bergmeyer // Jn: Bergmeyer H.V. (ed). Methoden der enzymatishen analyse – Bd. П. Wierhheim // Cnemic. – 1974. – S. 2174–2181.

10. Сонин Е.Ф. Основы биохимии мышц / Е.Ф. Сонин. – К.: Издательство Киевского университета. – 1960. – 181 c.

11. Atrinson D.E. The energy charge of the adenylate pools as a repylatory parameter. Interaction With ofeedback modifiers / D.E. Atrinson // Biochemistry. – 1968. – Vol. 7, 41. – P. 4030–4034.

12. Steiner A.L. Radioimmunoassay for measurement of cyclic nucleotides / A.L. Steiner, R.E.Wehmann, Ch.W. Parker // Advances in cyclic nucleotides research. – Raven Cress H.J. – 1972. – Vol. 2. – P. 51–52.