Фундаментальные аспекты и прикладные принципы лектиновых систем на примере симбиотических микробиоценозныхконсорциумов

Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С.

ФБУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора

      Аннотация. Дана оценка фундаментальным и прикладным перспективам лектиновых систем симбиотических микроорганизмов микробиоценозов биотопов организма человека. Симбиотические лектины рассмотрены как скоординированные системные метаболомбиотики, носители, доставщики и дозировщики гликополимерных метабиотиков, в том числе имитаторов поверхностноклеточных паттернов условнопатогенных микроорганизмов, пребиотиков, терапевтических агентов, антигенов, наборов декоров, поддерживающих нормально функционирующие ландшафты клеточных поверхностей человека. Симбиотические лектины, взаимодействующие с синтетическими гликополимерными имитаторами важных для организма соединений, важны для скринингового отбора симбиотических штаммов и их консорциумов с новым потенциалом для конструирования мультиштаммовых про- и симбиотиков органного типа. Предлагаемые анаэробные, не содержащие выраженных оксидоредуктазных систем, высокомолекулярные синергистические лектиновые препараты перспективны как мультифункциональные вспомогательные системы мягкой поддержки иерархичных защитных систем человека в условиях отсутствия достаточного и постоянного доступа кислорода.

     Ключевые слова: лектиновые системы, пробиотики, симбиотики, консорциумы, защита организма, бифидобактерии, лактобациллы, дрожжеподобные грибы, грамположительные бактерии.

      Summary. Fundamental and applied prospects of lectin systems of human symbiotic microorganisms. Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Aleshkin V.A., Afanasiev S.S. G.N. Gabrichevsky Research Institute for Epidemiology and Microbiology.

      Current evaluation of fundamental and applied prospects of lectin systems of human symbiotic microorganisms of human biotope microbiocenoses are presented. Symbiotic lectins are presented as metabolomebiotics, carriers, deliveries, and dosers of glycopolymeric metabiotics including antagonistic imitators of cellular surface patterns of relatively pathogenic microorganisms, prebiotics, therapeutic agents, décor panels of glycopolymers supporting normally functioning human cell surfaces as tissues and organs. Symbiotic lectins, interacting to synthetic glycopolymer imitators of important substances for human, serve instruments for screening symbiotic strains and their consortia possessing new potential for constructing multistrain pro- and symbiotics. Proposed anaerobic (without expressed oxidoreductase systems) highly molecular mass (in contrast to low molecular mass probiotic acidic effectors) synergistic lectin praparations are perspective as multifunctional assistive recognition systems supporting higher hierarchic human protective systems in the absence of local availability of oxygen.      

      Key words: lectin systems, probiotics, symbiotics, consortia, protection of organism, bifidobacteria, lactobacilli, yeast-like fungi, Gram-positive bacteria.      

      Введение. Лектиновые системы (ЛС) симбиотических микроорганизмов (ЛССМ), распознающих гликополимеры (ГП), остаются мало изученными. Цель обзора – на основании собственных данных оценить  фундаментальные и прикладные перспективы ЛССМ.

      Методы. Использовали штаммы лактобацилл и бифидобактерий из коллекции микроорганизмов нормофлоры человека нашего института, а также пробиотики Бифидина и Ацилакт - продукты нашего института. Бактерии выращивали на содержащих гидролизат казеина питательных средах. ЛСCМ выделяли из белковых фракций 27-220 кД изоэлектрофокусированием в пластине полиакриламидного геля в градиенте рН 4-8, белки идентифицировали электроблотированием на гидрофобную мембрану и окрашиванием флюоресцентным красителем SYPRO, распределение ЛС среди белкового массива определяли биотинилированными ГП на основе полиакриламидного (РАА) кора (www.lectinity.com; табл. 1), проявляемыми стрептавидин-пероксидазой в присутствии хемилюминесцентного субстрата пероксидазы в режиме живого изображения на дисплее компьютера в системе BioChemi System (UVP, Calif.). 

      Табл. 1. Использованные в работе синтетические ГП - имитаторы природных веществ (в скобках): 

1. α-D-GalNAc-PAA-biot          (муцины животных, T-антигены),

2. β-D-GalNAc-PAA-biot          (муцины животных),

3. β-D-GlcNAc-PAA-biot          (хитины насекомых, хитозаны),

4. β-D-Gal-PAA-biot                 (галактаны растений, животных),

5. β-D-Gal-3-sulfate-PAA-biot  (кислые галактаны животных),

6. α-D-Man-PAA-biot                (дрожжевые маннаны),

7. α-D-Man-6P-PAA-biot          (фосфоманнаны дрожжей),

8. α-L-Fuc-PAA-biot                  (фуканы бурых водорослей),

9. α-L-Rha-PAA-biotin              (рамнаны грамотрицательных бактерий),

10. MDP-PAA-biot                    (пептидогликаны бактерий),

11. Adi-PAA-biot                        (вещество AII-группы крови GalNAcα1-3Galβ1-),

12. Fs-PAA-biot                         (антиген Форсмана GalNAcα1-3GalNAcβ1-),

13.Tαα –PAA-biot                       (антиген бактерий Galα1-3GalNAcα1-)

      1. Симбиотические лектины – метаболомбиотики, доставщики и дозировщики метабиотиков. 

      ЛССМ функционируют как метаболомбиотики, а именно, регулируют метаболом по принципу «сеть-на-сеть». Организация сети ЛССМ: лектиновая молекула с определенной молекулярной массой представлена формами с варьирующим зарядом (представлена как ЛС со спектром биологических и физиологических активностей); при направленном и последовательно каскадном связывании углеводов и ГП ЛС трансформируется в разветвленную сеть комплексов и надмолекулярных ансамблей, у которых спектр лектиновых специфичностей динамично меняется (качественно и количественно изменяется как у форм, так и при оценке общего вектора направления специфичности ЛС). Результирующая сеть ЛССМ регулирует сетевой метаболом биотопа, в котором участвуют углеводы и ГП (углеводсодержащие ферменты и факторы, рецепторы, другие), является частью метаболома, обладающего способностью обратно направленного и обратимого (в рамках допустимо происходящих естественных биоритмических колебательных отклонений от среднего) влияния на ЛССМ. Адаптационный характер функционирования ЛССМ микробиоценоза в биотопе зависит от своеобразия развитой в процессе совместной эволюции сформированной организмом-хозяином инфраструктуры органы-подобного окружения в биотопе так, что создается адекватная биотопу сеть ЛССМ, сориентированная на имеющийся и доставляемый извне адекватный ранжированный по сродству к ЛССМ ряд биологически активных ГП (в том числе пребиотиков и терапевтических агентов). В результате в биотопе функционирует дежурная адаптационная устойчивая к колебаниям инфраструктура обратимых взаимодействий сеть ЛСМ—ГП. Комплексы и ансамбли ЛССМ—ГП функционируют как безклеточные/ безмикробные имитаторы симбиотиков, с направленными и предсказуемыми активностями. При этом новые полезные свойства ЛССМ могут быть прогнозированы и проверены, исходя из того, что ЛСCМ образуют функциональное суперсемейство пробиотических лектинов и лектинов азотфиксирующтих бактерий, члены нового класса деструкторов биопленок дрожжеподобных и грамположительных патогенов; участники Quorum Sensing (QS) и Cross-Talking (с развитыми защитными системами хозяина) в биотопах; синергисты с другими антимикробными агентами. ГП с известной химической структурой (www.lectinity.com), являясь потенциальными метабиотиками, используют ЛСCМ как носители. Синтетические ГП лучше имитируют важные для антимикробного действия бактериальные (протеогликановые) и грибковые (маннановые и содержащие экспонированные остатки N-ацетилглюкозамина ГП) молекулярные структуры при сравнении с низкомолекулярными фрагментами, а ЛСCМ осуществляют доставку и депонирование антагонистических патогенам ГП с последующим их высвобождением как пребиотиков и терапевтических агентов. ЛССМ участвуют в поддержании/ восполнении нормального ГП-декора клеток тканей и органов, что не позволяет убыстрение развития появившихся или уже имеющихся некоторых клеточных аномалий (в том числе «доброкачественных» опухолей). Системы ЛССМ—ГП не только разрушают и деградируют неблагоприятные для человека микробиоценозные массивы и биопленки, но и, возможно, способствуют их изоляции и консервации, что, в конечном счете, предотвращает раннее развитие болезней, а в некоторых случаях приводит к повышению качества жизни пациента.

      2. Скрининг и отбор симбиотических штаммов и их консорциумов с новым потенциалом для конструирования мультиштаммовых про- и симбиотиков.

      Поиск, отбор и  селекционное улучшение антимикробных и других свойств пробиотических культур штаммов и консорциумов микроорганизмов кишечника человека, направленных на группы условнопатогенных микроорганизмов, является важной стратегической задачей профилактики болезней, повышения общей резистентности организма и ускорения процессов реабилитации пациентов.

     На основании собственных результатов нами предложен алгоритм поиска пробиотических микроорганизмов и их консорциумов с выраженными антимикробными  ЛС для конструирования новых пробиотиков. Алгоритм включал: а) отбор синтетических ГП, имитирующих протеогликаны бактерий и (фосфо)маннаны дрожжей; б) идентификацию в белках 27-220 кД концентратов культуральных жидкостей ГП-связывающих ЛС в интервале pI 4-8; в) сравнение ГП-зависимых ЛС (общая интенсивность, широта распределения, мозаичность и ассиметричность распределения форм, мажорные формы как доминирующие в выполнении антимикробных функций; минорные формы как экспрессирующиеся сигнальные регуляторы биораспознавания, дополнительные участники узнавания ГП); г) идентификацию уникальных компонентов ЛС; д) установление комбинационных наборов антимикробных форм ЛС для испытания. 4. Подтверждение присутствия антимикробных ЛС варьированием проявления антимикробных активностей препаратов ЛС. 

      Предложенный алгоритм расширяет потенциал использования традиционных пробиотиков, открывает возможности исследования функциональной роли других ЛС и их комбинаций, распознающих другие типы ГП, участвующих в интерактомной сети человека.

      3. Анаэробные высокомолекулярные синергистические биопрепараты поддержки защитных систем человека в условиях отсутствия кислорода - для конструирования поддержанных пробиотическими лектинами лекарственных форм.

      Нами получены из культур симбиотических (пробиотических) штаммов бифидобактерий и лактобацилл человека системные «анаэробные»  препараты кислых и щелочных лектинов, относящихся к ГП-распознающим белкам, не содержащих оксидоредуктаз/ оксидаз окислительного стресса, которые требуют присутствия кислорода, обладают деструктивным в отношении окружающей инфраструктурной среды действием, снижают (могут инактивировать) исходную эффективность биопрепаратов. Используемые в работе синтетические ГП обладали дополнительными антиоксидантными свойствами и защищали ЛС от деградации, как и в случае присутствия защитных околонейтральных и щелочных природных экзополимерных соединений  не белковой природы. Кислые и щелочные анаэробные ЛС бифидобактерий и лактобацилл обладали антипатогенным действием (самостоятельным и перекрывающимся – синергистическим; в отношении «коммуникативных тел» [массивов и биопленок] дрожжеподобных грибов и грамположительных бактерий);  характеризовались собственными механизмами антимикробного действия при сравнении с механизмами действия других антимикробных систем (антибиотиков, бактериоцинов, нетоксичных фитолектинов, субизотипов изотипов С4В и С4А компонента С4 комплемента человека). ЛС культур пробиотических бактерий человека обладали способностью каскадно «запускать»/ заменять/ переключать распознавание ГП разных типов (в том числе имитаторов маннанов, муцинов, компонентов бактериальных пептидогликанов; антигенов Форсмана, АII-группы крови, Tn) одним и тем же исходным пулом лектиновых форм штаммового/ мультиштаммового пробиотика. Присутствие катионов Ru2+ (ингредиента SYPRO) резко повышало обособленность/ дискретность и число форм кислых лектинов – носителей и доставщиков ГП.  Наблюдалась стабильность мозаичных ассиметричных картин систем ЛС-ГП, (мульти)пробиотик-зависимых, поддерживающих в биотопах баланс распознавания и обратимого удерживания/ депонирования ГП (терапевтических, маркерных, других). Комбинации анаэробных лектины-содержащих белков проявляли себя в отношении дрожжеподобных и грамположительных патогенных мишеней как более селективные к выбору территории массива патогена, времени эффективного воздействия на массив патогена, достижению более однородного результата (его «чистоты») в области эффекта (отсутствие или минимизация остаточных резистентных к ЛС колоний патогена в пределах подверженной деградации территории кандид, особенно в системе «ЛС кишечных бифидобактерий и лактобацилл—Кишечные C. albicans»), эффективные и предсказуемые по сравнению с лектины-содержащими препаратами травяных не бобовых растений медицинского значения. Антимикробная активность ЛС также могла осуществляться не только напрямую, но и через влияние  (совместно с ГП) на миграцию макрофагов и проявляться в реакции индуцирования стимуляции синтеза лимфоцитами крови цитокинов (например, фактора-альфа некроза опухолей). Результаты указывают на перспективность анаэробных ЛС как вспомогательных ингредиентов лекарственных форм.

      4. Минибиореактор для синбиотического скрининга с участием лектинов пробиотиков и гликополимеров.

      ЛССМ относятся к новому классу антипатогеннных распознающих ГП белков и их комплексов; представляют собой мультифункциональные системные высокомолекулярные (в противоположность низкомолекулярным) метаболиты культур микробиоты человека, консорциумов индигенных микроорганизмов микробиоценозов нормофлоры человека, моно- и мультиштаммовых пробиотиков.  ЛССМ кофункционируют с природными ГП и имитирующих их синтетическими ГП.

      На основании собственных результатов нами была предложена система для скрининга пребиотических и терапевтических ГП в стерильных инсулиновых гепаринизированных шприцах объемом 1 мл. Получены следующие результаты. 1. ЛССМ-содержащая фракция стимулировала увеличение общей и адгезирующей биомассы бифидобактерий. LiCl дозозависимо увеличивала число адгезированных колоний. 2. При доступе кислорода (ЛССМ и оксидоредуктазы)-содержащая общая фракция стимулировала окислительный метаболизм лактобацилл. 3. Лактобациллярные и бифидобактериальные ЛССМ (pI 4-4,5) характеризовались сильным сродством к анионным ГП (с экспонированнными остатками сульфатированных галактозидов и, в меньшей степени выраженным сродством в кислой области в отношении остатков маннозо-6-фосфата). Сульфатированные гликозаминогликаны вместе с катионами Li+ и лектиновыми носителями катионов Li+ участвовали в функционировании  синбиотопа (повышалась выживаемость пробиотической микробиоты).

      Предложенная система перспективна для скрининга пребиотических ГП, поддержанных посредством ЛССМ и катионами Li+, а также для оценки влияния терапевтических ГП на выживаемость симбиотической микробиоты.

      5. Технологические перспективы лектинов симбиотических микроорганизмов.

      ЛСCМ – полезные для человека белок/пептиды-содержащие вещества и их комплексы, распознающие ГП, имитирующие пробиотики, представители нового класса бактериоцины-подобных деструкторов биопленок патогенов, кофункционирующие с ферментами всех известных  классов, проявляющие антипатогенный синергизм в различных комбинациях (внутривидовых – лактобациллярных, межвидовых – бифидобактериальных/ лактобациллярных, межродовых – лактобациллярных и бифидобактериальных, между лектинами пробиотиков и фитолектинами, между ЛСCМ и антибиотиками, в том числе антимикотиками). Предложены мембранные технологии для использования препаратов ЛССМ человека, ЛС белкового гормона человека и ЛС растений в лекарственных формах и для нужд индустрии: 1. Технологии использования аффинных пористых гидрофобных мембран с предсказуемо распределенными  мозаиками высокоочищенных полифункциональных наборов ЛCСМ (достигается значительная дополнительная очистка ЛС, сорбированных на мембранах). Перспективы – антигрибковые покрытия пролонгированного действия (в сочетании с антимикотиками), кофункционирующие в режиме реального времени хемилюминесцентные системы для медицинской и промышленной биотехнологии и бионанотехнологий («Слабокислые лактобациллярные ЛС – Слабокислые лактобациллярные оксидоредуктазы», «Щелочные бифидобактериальные ЛС – Щелочные бифидобактериальные экзополимерные соединения», «Околонейтральные лактобациллиярные/ бифидобактериальные ЛС – Околонейтральные лактобациллиярные/ бифидобактериальные биосурфактанты», «ЛС – Сильнокислые сериальные фитооксидоредуктазы/ фито[глико]оксидазы», «Эритропоэтиновые ЛС – Иммунный сэндвич/ моноклональные антитела/ синтетические ГП с имитирующими муцины и антигены свойствами»). 2. Мембранные технологии использования разделенных белков, олигопептидов и их комплексов (в особенности) с собственными и привнесенными флюоресцентными свойствами (окрашивание SYPRO) с регистрацией свечения в живом изображении. Достигаются определение границ белковых массивов, в которых могут идентифицироваться ЛCСМ и выбираться сочетания ЛС с прочими биологически и физиологически активными белками, экспресс-ранжирование групп белков и ЛС по массе в высокомолекулярных фракциях культуральных жидкостей для стандартизации и типирования штаммов и оценки питательных сред, межштаммовый синергизм систем протеаз или систем оксидоредуктаз мультиштаммовых пробиотиков и консорциумов, идентификация мозаики комплексных флюорохромов в интервале pI 4-8 (как носителей энергии и способности к сигнальному обмену энергией с окружающей инфраструктурной средой, для мониторинга надмолекулярных сборок и их перестройки).    

      Заключение. ЛССМ и соответствующие им ГП способствуют сбалансированному функционированию в организме созданных в процессе эволюции органо-подобных областей взаимного интереса человека и биотопных микробиоценозов. Поэтому системы ЛССМ—ГП являются важными перспективными элементами интерактома человека, проявляющими себя как инфраструктурные, сигнальные, антимикробные, антивирусные, влияющие на чувство кворума (QS) в условиях сбалансированного биотопного микробиоценоза, вспомогательные для кофункционирования с иерархически продвинутыми защитными системами человека в рамках перекрестных переговоров (Cross-Talking).

      Литература.

1. Лахтин М.В., Лахтин В.М., Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Алешкин А.В. Лектины и ферменты в биологии и медицине. - Москва: Издательство «Династия», 2010. – 496 с. ISBN 978-5-98125-076-7.

2. Lakhtin M., Lakhtin V., Aleshkin A., Bajrakova A., Afanasiev S., Aleshkin V. Lectin systems imitating probiotics: potential for biotechnology and medical microbiology // In: “Probiotics 2012”, Edited by E.C. Rigobelo. – New York, InTech, 2012. – P. 417 – 432. ISBN 978-953-51-0776-7. http://dx.doi.org/10/5772/3444

3. Lakhtin V.M., Lakhtin M.V., Bajrakova A.L., Afanasiev S.S. Candida albicans: New Aspects of Patogenicity, Interaction to Antifungals, Biofilms and Preventive Anti-Candida Strategies - The Overview of Own Works / // In: Candida Albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. Eds L.A. Dietrich and T.S. Friedmann. New York: Nova Science Publishers, 2013: 145-152. ISBN: 978-1-62808-883-0(eBook). Library of Congress Control Number: 2013947024. ISBN: 978-1-62808-882-3. 

4. Lakhtin M., Lakhtin V., Afanasiev S., Bajrakova A., Aleshkin V., Afanasiev M.S., Karaulov A.V., Korsun V. Human Healthy Status Supported by Probiotic Systems Recognizing Glycoconjugates: One more Strategy of Supporting Healthy Biotope // European Science and Technology [Text] : materials of the IX international research and practice conference, Munich, December 24th – 25th, 2014 / publishing office Vela Verlag Waldkraiburg – Munich – Germany, 2014 – pp.414-422. ISBN 978-3-941352-42-1. Ninth edition 2014

5. Lakhtin M., Lakhtin V., Afanasiev S., Aleshkin V. Mucosal innate immunity involves system “Lectins of probiotics—Glycopolymers” against pathogens  // In: Microbiology Book Series #5: “The Battle Against Microbial Pathogens: Basic Science, Technological Advances and Educational Programs”. A. Méndez-Vilas (Ed.). Formatex Research Center.  Volume 2 ISBN (13): 978-84-942134-7-2, December 2015; pp.668-677. [Publisher: Formatex Research Center. Volume 2 ISBN (13): 978-84-942134-7-2. ISBN-13 Vol. 2: 978-84-942134-7-2 ISBN-13 Collection: 978-84-942134-5-8; Publication date: December 2015].