Биологические науки/Микробиология

Лахтин М.В., Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А.

Московский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

Функциональные сборки биопленок в микропанелях

Резюме. Обобщены собственные результаты исследования твердофазных клеточных биопленок с участием  лектинов пробиотических микроорганизмов человека и гликоконъюгатов.     

      Ключевые слова: пробиотические лектины, гликоконъюгаты, бифидобактерии, лактобациллы, пробиотики, грибы, биопленки, сборка, деградация.

Resume. Functional assemblies of biofilms in micropanels. Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Afanasiev S.S., Aleshkin V.A. Moscow Research Institute for Epidemiology & Microbiology after G.N. Gabrichevsky, Russia. Own results on study of solid phased cell biofilms involving lectins of human probiotic microorganisms as well as glycoconjugates are summarized.

      Key words: probiotic lectins, glycoconjugates, bifidobacteria, lactobacilli, probiotics, fungi, biofilms, assembling, degradation.

Введение. Лектины (белки и белок-содержащие комплексы) распознают гликоконъюгаты (ГК), действуют как индукторы и антагонисты цитоагглютинатов (ЦА, в том числе гемагглютинатов [ГА]) и биопленок (БП), кофункционируют  с ферментами и антимикробными веществами, являются сигналами межклеточных коммуникаций в биотопах. ЦА и БП широко применяются в диагностике. Цель - обобщить собственные  результаты по функциональной диагностике сорбированных клеточных систем в микропанелях.

Материалы и методы. 1. Полистироловые кругло- и плоскодонные микропанели (КДМП, ПДМП), ГК «Углеводы-полиакриламид(ПАА)» (www.lectinity.com), конканавалин А (КонА) (Sigma), анионные лектины пробиотических бактерий (ЛПБ лактобацилл и бифидобактерий [ЛЛ, ЛБ]),  лектины базидиальных грибов (ЛБГ), трипсин (Spofa), сиалидаза C.perfringens (Grade V, Sigma), эритроциты (Эц) групп крови А(II) и В(III), глютаровый альдегид (25%, Reanal), фосфатно-солевой буфер рН 7.2 (ФСБ), физраствор, коммерческие лиофилизированные дрожжи S.cerevisiae, штаммы кандид и лактобацилл. 2. Обработанные гидролазой Эц (трЭц: инкубация 10% Эц с трипсином 0.1 мг/мл, ночь, в ФСБ; сиЭц: обработка сиалидазой, как при десиалировании сыворотки; титр КонА улучшался до 100 раз). Клетки с экспонированными остатками GalNAc и Gal имитировали муциновую поверхность. Обработка альдегидом клеток приводила к снижению адгезии и выраженности ГА, необратимому нарушению картины ГА после  ресуспензирования клеток. 3. Суспензионные формы лектинов (СФЛ) получали инкубацией трЭц/сиЭц в ФСБ с субагглютинирующими концентрациями лектинов. Использовали СФЛ: трЭц-ЛЛ/ЛБ/ЛБГ, сиЭц-ЛЛ/ЛБ/ЛБГ. Стабильность систем – не менее недели (4оС, в темноте, периодическое промывание в ФСБ, в том числе перед использованием). 4. Дрожжи (устойчивые 10% суспензии в ФСБ). Проявление ЦА редактированием контраста и яркости. 5. Кандиды и лактобациллы (суспензии 1 ед. мутности по Макфарланду, в физрастворе). 6. ГА получали в КДМП в серийных разведениях (СР) лектинов в ФСБ (2 ч, комнатная температура; или ночь, 4оС) добавлением моносистемы трЭц/сиЭц или парных комбинаций моносистемы (конечные концентрации 0.5-2%). 7. Исследовали влияние СР ЛПБ на суспензии кандид в течение 1-3 суток инкубации при комнатной температуре в ПДМП. 8. БП кандид и лактобацилл получали в среде MRS в ПДМП (48 ч, 37оС). Дрожжеподобные грибы и бациллы смешивали по 30-40 мкл суспензий (80 мкл для монокультур)  в конечном объеме 250 мкл в лунках со средой.  БП окрашивали, краситель измеряли, штаммы ранжировали по выраженности БП, выявляли штаммы влияния лактобацилл (или кандид) на пулы кандид (или лактобацилл). 9. Картины фотографировали, сканировали, редактировали в системе Windows и с использованием программ BioChemi System (UVP).

Результаты. 1. ГА-чувствительность ЛПБ снижалась в ряду сиЭц> трЭц>> нативные Эц. Проявление лектинов в СР клеточной парой (твердофазный лектин + лектин-трЭц + трЭц/сиЭц) усиливало ГА до 1000 раз. Результаты характеризовали способность клеток сорбировать лектины и полноту их сорбции (истощение лектинов в луночных надосадках). Достигалось дозозависимое снижение ГА в СР лектинов  без рассасывающих агглютинаты активностей (РАА) и гемолиза при хранении. Пара сиЭц-сиЭц выявляла лучшие титры ЛЛ (1-2 мкг/мл) и ЛБ (4-8 мкг/мл). 2. При избыточной трипсинизации круговые ГА трЭц в отсутствие внесения лектинов экспонировали собственные лектины (в том числе гликофорин М), ингибируемые (превращение кругов в точки) добавлением метилированного галактопиранозида (Me-альфа-D-Galp), но не Ме-альфа-D-Manp. 3. Наблюдалось полное рассасывание ЛПБ-индуцированных ГА сиЭЦ/трЭц при ресуспендировании ГА после добавления GalNAc-ПАА (1-5 мкг/мл), частичное рассасывание – в присутствии Man-ПАА/Man-6-P-ПАА> GlcNAc-ПАА. 4. Двумерные картины ГА с РАА в КДМП (СР в одном направлении, а затем – в других) давали уникальную характеристику препаратов ЛБГ, выявляли [лектиновые системы] микрогетерогенность фитолектинов. Удаление надосадков в (СР лектина)-сенсибилизированном КДМП снижало РАА, а пары систем Эц увеличивали титры лектиновых и имитирующего лектины ингредиентов препарата. 5. Сборки пар (ЛБГ-трЭц/сиЭц)А—(ЛЛ/ЛБ-трЭц/сиЭц)Б и Б—А в ЛБГ- или ЛПБ-сенсибилилизованной КДМП. В случае сборки на ЛБГ участие экзополисахаридов (ЭПС) консервировало БП на длительный срок, а в случае сборки на ЛПБ наблюдалась деградация БП, скоординированная с типом ЛБГ. При хранении усиливались сшивки ГА. 6. Взаимодействие  ЛБ и ЛЛ с кандидами было диагностическим - штамм/вид-зависимым. 7. БП-образование микроорганизмами визуально характеризовалось, по крайней мере, 4 визуальными параметрами структурно-слоевой организации. Выявлены диагностические штамм-зависимое  продуцирование кандидами ЭПС (в составе БП или верхнего слоя, подобно  случаям ГА ЛБГ), наличие РАА гидролазной природы (потенциальных факторов вирулентности). 8. БП-образование  системой «Лактобациллы—Кандиды». Выявлены различия БП кандид и лактобацилл. Установлены признаки штаммов межпулового влияния (лидерных штаммов) на БП-образование смешанными культурами. 9. Прилагается каталог фотографий.

 Заключение. Результаты демонстрируют потенциал активностей лектинов, ГК, ЭПС, гидролаз, оксидоредуктаз, микробных клеток и клеток человека в составе функциональных ЦА и БП. Перспективы ЛПБ: доставочные носители анионных/ нейтральных ГК и катионных эффекторов; скрининг ГК и кофункционирование с ГК; конструирование бифункциональных ГК – пребиотиков и антагонистов патогенных микроорганизмов, факторов противодействия метастазированию опухолевых клеток; сборочное кофункционирование с лектинами клеточных систем; вспомогательные инструменты создания направленных функционально активных клеточных ландшафтов; системные дезорганизаторы и разрушители биопленок патогенов.