Биологические науки/Микробиология

Лахтин М.В., Лахтин В.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А.

Московский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, Россия

Ранжирование макропараметров культур грамположительных бактерий для конструирования консорциумов и штаммов

на примере бифидобактерий и лактобацилл

Резюме. Предложены алгоритмическая кодовая запись ранжирования штаммов по каждому из макропараметров сравнения культур, оценка гидролитического потенциала культуры. Результаты перспективны для конструирования консорциумов штаммов.

Ключевые слова: бифидобактерии, лактобациллы, пробиотики, консорциумы, пробиотические лектины, гликоконъюгаты, культуры, среды.

Resume. Ranging macroparameters of cultures of Gram positive bacteria for constructing consortia and strains on example of bifidonacteria and lactobacilli. Lakhtin M.V., Lakhtin V.M., Afanasiev S.S., Aleshkin V.A. Moscow Research Institute for Epidemiology & Microbiology after G.N. Gabrichevsky, Russia. Algorithmic code ranging strains on macroparameters of microbial culture as well as evaluation of cultural hydrolytic potential are described. Results are perspective in constructing multistrain consortia.

Key words: bifidobacteria, lactobacilli, probiotics, consortia, probiotic lectins, glycoconjugates, cultures, media.

Введение. Пробиотические бифидобактерии и лактобациллы (ПБ, ПЛ) важны для поддержания здорового статуса организма. Отбор комбинаций штаммов ПБ и ПЛ в консорциумы требует диагностики их ключевых свойств (макрофункций). Цель - обобщить собственные результаты исследования ПБ и ПЛ для конструирования мультиштаммовых консорциумов.

Материалы и методы. Штаммы L.helveticus NK1 (1), L.helveticus 100_аш (2) и L.casei К₃III₂₄ (3) - ингредиенты Ацилакта (4), штаммы B.adolescentis spp. longum МС42 (5), B.bifidum №1 (6), B.gallinarum ГБ (7), B.breve 23, B.longum B379M, B.infantis 302-87 - из коллекции микроорганизмов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. Использовали супернатанты и концентраты высокомолекулярных компонентов (более 27 кД) культур бактерий, выращенных в Бифидум-среде или среде КД-5с 18-24 ч при 37^оС. Компоненты оценивали низковольтным изоэлектрофокусированием (600-700 В) в полиакриламидном геле (ИЭФ-ПААГ) в присутствии 7-8 М мочевины и 5% сахарозы (ночь, 8-10^оС), электроблотированием на иммобилоновую мембрану (дополнительная очистка компонентов) и проявлением флюоресцентным красителем SYPRO Ruby protein blot stain (Bio-Rad) или меченым биотином псевдополисахаридом и затем – Стрептавидин-пероксидазой в присутствии хемилюминесцентного субстрата пероксидазы BioWest (с повышенными чувствительностью и стабильностью). Использовали спектрофотометрическое определение белков и пептидов, стандартный колоночный анализ аминокислотного состава. Биосурфактанты определяли нашим методом (регистрировали диаметры просветления в пленке машинного масла на поверхности дистиллированной воды после добавления концентратов культур). Свечение регистрировали в камере системы BioChemi System (UVP). Использовали рН-метр «рН Analyzer MA235 Mettler Toledo» (Швейцария). Показатель деградации (Д), пропорциональный обратным величинам степени закисления (рН) и времени установки постоянного рН (Т, секунды) в супернатантах и концентратах, измеряли по нашей формуле Д=1/(pH х Т). Подтверждением деградации служили картины ИЭФ-ПААГ и блотов.

Результаты. 1. Предложена сравнительная оценка способности к кофункционированию штаммов ПБ и ПЛ посредством их ранжирования (на примере 6 штаммов и Ацилакта) по выраженности следующих макрофункциональных параметров концентратов, их фракций и компонентов [семикодовая запись для 7 штаммов, в порядке снижения выраженности параметра]: (аналог альфа-маннана)-связывающие лектины [pH 4-5.5: 2-3, 3-2, 1, 5, 7, 4, 6; pH 5.5-8: 7, 6, 5, 1, 4, 2-3, 3-2], (аналог муцина)-связывающие лектины [pH 4-5.5: 7, 4, 1, 5, 6, 3-2, 2-3; pH5.5-8: 5, 6, 7, 1, 4, 2-3, 3-2], ассоциированные биосурфактанты [рН 4-8: 6, 7, 3, 4, 2, 5, 1; «NK1+ГБ» и «NK1+№1» как потенциальные синергистические антимикробные комбинации], водонерастворимые бесцветные прозрачные адгезины на полистироле [рН 4-8: 7, 5, 1, 6, 4, 3-2, 2-3; вместе с вкладом выраженности эмульсифицированности/ дисперсности капельных адгезинов], общий белок (пептидные связи) [pH 4-6: 1, 5, 3, 7, 2, 6, 4; pH 6-8: 1, 7, 3, 5, 2, 4, 6], образование органических кристаллов типа мочевины [pН 4-6: 3-2, 2-3, 4, 1, 5, 6, 7; pН 6-8: 3-2, 2-3, 4, 1, 7, 6, 5], антифризность (отсутствие кристаллов) в присутствии 7-8 М мочевины [рН 4-8: 7, 6, 5, 1, 4, 3-2, 2-3]. Принцип комплементарности штаммов, работающий на примере ингредиентных штаммов Ацилакта (взаимодополнение ингредиентных штаммов макрофункциями в консорциуме), предложен для конструирования смешанных консорциумов типа «ПБ+ПЛ» [потенциальных синбиотиков]. Бифидобактерии являлись донорами катионных экзополимерных соединений (ЭПС) и сцепленных с ними белков [донорами сцепленных ЛС], Trp- и Pro-содержащих соединений для комбинирования с лактобациллярными протеолитическими системами. Системы «100_аш+МС42» и «100_аш+№1» проявляли свойства потенциальных продуцентов антигипертензивных ProPro- (одновременно антимикробных) и LeuLeu-содержащих пептидов. В случае лактобацилл результирующее/ остаточное/ не потребленное содержание бактериоцин-подобных комплексов в консорциуме по данным электрофореза было минимальным (снижение как результат коммуникационных «затрат» [потреблений, деградации, необратимой ассоциации и модификации] в процессе сосуществования штаммов). Сравнение способности концентратов бифидобактерий и лактобацилл «разрыхлять» биоосадки, «тромбировать» поры, «размягчать» полистироловые наконечники выявило новые штамм/ консорциум- зависимые качества пробиотических ассоциирующихся метаболитов. Аминокислотный анализ супернатантов диагносцировал МС42 как преимущественный источник Lys (MC42>> NK1); NK1 и МС42 - преимущественные источники Tyr и как сильно различающиеся по содержанию Lys, Ile, Ala, Ser, Met (потенциал взаимного донорства аминокислот и их ди- и трипептидов между штаммами в консорциуме). 2. Предложен визульный контроль гидролитического потенциала посредством оценки деградации компонентов по данным ИЭФ-ПААГ, регистрации рН среды и времени ее ответа. Степень деградации полимеров снижалась у штаммов: А) в Бифидум-среде: а) ПЛ: Ацилакт, 100_аш, NK1; б) ПБ: B379M, 23, ГБ, №1, 302-87, МС42; Б) в КД-5с: а) ПЛ: K₃III₂₄, 100_аш; б) ПБ: B379M, МС42, ГБ, №1. Результаты подтверждены ЭФ-ПААГ. Присутствие ЭПС усиливало вязкость среды [ограничение при оценке гидролитического потенциала].

Заключение. Результаты демонстрируют перспективность алгоритма ранжирования макрофункций микробных культур для конструирования межвидовых консорциумов и их ключевых штаммов- ингредиентов. Возможна сравнительная оценка среды для каждого выбранного штамма. Возможны отбор и селекция штаммов и их комбинаций (растущих в идентичной среде) для новых консорциумов. Результаты указывают на способность биотопа индуцировать выраженный локальный гидролитический потенциал ПБ и ПЛ в ответ на появление/ присутствие патогенов, что является одним из важных условий повышения резистентности биотопа к инфекциям.