Сельское хозяйство/ 5. Растениеводство, селекция и семеноводство

Н. Ю. Ван-Ункан, О. Я. Олейникова

ФГБНУ ВНИИГиСПР имени И. В. Мичурина, г. Мичуринск, Россия

e-mail: cglm@rambler.ru

Разработка приемов размножения побегов-регенерантов колонновидных форм яблони в условиях in vitro

Современные методы биотехнологии позволили значительно повысить эффективность клонирования растений. Исследования в области культивирования соматических тканей привели к разработке принципиально новых методов размножения – клональное микроразмножение. В сущности, эти методы аналогичны вегетативному способу размножения и различаются лишь тем, что весь процесс протекает в условиях in vitro [2, 3, 4]. Главное условие клонального микроразмножения – получение растений, полностью сохраняющих генетическую однородность. Поэтому для этих целей предпочтительнее использовать культуру апексов (меристематических верхушек), т.к. в условиях in vitro они являются генетически стабильными, и пролиферирующие ткани всегда остаются диплоидными [4].

При клональном размножении различных сортов и подвоев яблони была отмечена значительная сортоспецифичность, что является следствием высокой гетерозиготности рода [1, 5]. Для эффективного размножения каждого генотипа необходима разработка индивидуальных условий. Каждый этап микроклонального размножения предусматривает определенный состав питательных сред в соответствии с задачами данного этапа.

Целью наших исследований было разработать методы клонального микроразмножения колонновидных форм яблони для максимального выхода микропобегов.

Методика и материалы исследований

Материалами исследования служили апикальные почки 7 перспективных форм яблони, полученных на основе гибридизации колонновидных форм (32-26, 18-9, 18-6) и клоновых подвоев (7-22, 9-26, 5-24).

В культуру in vitro вводили меристематические верхушки, которые изолировали из развивающихся почек, освобождая их от покровных тканей, что обеспечивало достаточно эффективную стерилизацию. В качестве стерилизующего агента использовали 0,1 % раствор ртути (сулемы).

Для снятия апикального доминирования и заложения боковых почек в инициальную питательную среду Мурасиге-Скуга, добавляли 0,5 мг/л 6-БАП (0-й пассаж). Регуляторы роста ауксиновой природы не добавляли, так как на данном этапе они негативно влияли на процесс морфогенеза и стимулировали нежелательный каллусогенез. На этапе собственно микроразмножение использовали среды с различными концентрациями 6-БАП от 0,5 до 2,0 мг/л

Условия культивирования апексов: t = 23±2 ^оС, 16-часовой фотопериод, интенсивность освещения 2000-3000 люкс.

Результаты исследований

Проведенные исследования показали, что для колонновидных форм яблони лучшие результаты дает введение в культуру in vitro меристем из апикальных почек, собранных в период начала вегетации растений. В зависимости от погодных условий этот период приходится на середину или конец апреля, когда происходит естественное набухание и распускание почек. По нашим данным лучшие результаты по выходу микропобегов дает использование почек размером 3-4 мм.

На этапе стерилизации 0,1 % раствором сулемы исходного материала были испытаны 2 экспозиции – 1 минута и 40 секунд. Наибольший выход стерильного материала (до 75%) был достигнут при экспозиции 1 мин. Экспозиция 40 секунд вызывала значительную инфицированность исходного материала (выход стерильных составил всего 13,3 %).

На этапе введения исходного материала (0-вой пассаж) на среде для снятия апикального доминирования наиболее высокий уровень развития апексов отмечен у форм VII и VIII. Показатели образования розеток листьев с зачатками почек составил в среднем 30%. Уже на инициальной среде у формы VII были образованы дополнительные побеги-регенеранты, в среднем около 5 на один исходный эксплант, что говорит о высоком морфогенетическом потенциале данного генотипа. У других испытанных форм в основном было отмечено слабое увеличение размера эксплантов и развитие 1-2 примордиев. Дополнительные побеги были единичные. Наименьшей морфогенетической способностью характеризовалась форма IV. Таким образом, отмечены определенные генотипические особенности развития апексов в 0-вом пассаже.

На этапе размножения in vitro микропобегов (1-й пассаж) колонновидных форм яблони нами были испытаны питательные среды с тремя различными концентрациями 6-БАП (0,5; 1,0; 2,0 мг/л).

В результате исследований, к концу четвертого месяца размножения микропобегов лучшие результаты по выходу дополнительных побегов у большинства форм (кроме IV и V) были получены при концентрации 6-БАП 0,5 мг/л (табл.).

Таблица − Коэффициент размножения микропобегов яблони на средах с различными концентрациями 6-БАП

Форма	Концентрация 6-БАП в питательной среде, мг/л
	0,5	1,0	2,0
I	0,5	0	0
III	1,3	0	0,3
IV	0	1,2	15,5
V	0	0	0
VI	0,5	0,8	0
VII	8,2	0	0
VIII	19,0	4,0	0

Самый высокий коэффициент размножения (19,0) был на этой среде у формы VIII. Данная среда оказалась наиболее благоприятной и для формы VII (8,2). Среды с 1 и 2 мг/л 6-БАП для большинства изученных генотипов были менее благоприятны. Только для формы IV среда с 2 мг/л оказалась лучшей (15,5).

В целом, можно отметить, что реакция инициальных микропобегов на концентрацию 6-БАП в среде размножения зависит от конкретного генотипа, то есть от его генетических особенностей. Для размножения in vitro форм VIII и VII следует использовать среды с 0,5 мг/л 6-БАП, а для IV – 2 мг/л. Остальные формы оказались мало отзывчивыми на испытанные среды (0,3 – 1,3). Форма V не образовала дополнительных побегов не на одной из испытанных сред. Очевидно, для этих генотипов требуется проведение дополнительных исследований в данном направлении.

Формы IV, VII, VIII, показавшие высокую способность к размножению, в дальнейшем использовались для изучения способности к укоренению in vitro.

На этапе укоренения образовавшихся микропобегов были испытаны 4 концентрации ИМК 0,5;1,0; 2,0; 3,0 мг/л. Проведенные исследования показали, что у всех изученных генотипов самое активное корнеобразование – от 31,0 до 54,1% − дает присутствие в питательной среде ИМК в концентрации 1 мг/л. Близкие показатели по укоренению (32,8 – 43,8%) получены также при концентрации 0,5 мг/л. Концентрация ИМК 1 мг/л также дает наибольшую длину корней – до 3,4 см. Более высокие концентрации ИМК (2 и 3мг/л) часто приводили к образованию на базальном участке микропобегов каллуса, это вызывало снижение укореняемости и, как следствие этого, снижало жизнеспособность регенерантов, что приводило в целом к снижению укореняемости микропобегов. Минимальной (20,1 – 28,7%) она была у всех генотипов при 3 мг/л ИМК.

Таким образом, для колонновидных форм яблони разработана методика клонального микроразмножения которая включает использование для этих целей апикальных почек размером 3-4 мм, их стерилизацию 0,1 % раствором сулемы в течение 1 минуты, культивирование на инициальных питательных средах с 0,5 мг/л 6-БАП размножение на средах, в зависимости от конкретного генотипа с 0,5 и 2 мг/л 6-БАП, а также их укоренение с добавлением ИМК 0,5 и 1 мг/л. Выделены перспективные в отношении микроклонального размножения генотипы IV и VIII, полученные от скрещивания колонновидной формы 32-26 с клоновым подвоем 5-24, а также форма VII, полученная в результате гибридизации клонового подвоя 7-22 с колонновидной формой 32-26.

Литература

1. Бартиш, И.В. Оптимизация методов культивирования in vitro различных сортов и клоновых подвоев яблони (Malus domestica Borkh.) / И.В. Бартиш, В.И. Корховой, С.М. Меркулов, В.П. Копань // Физиология и биохимия культурных растений. – 1994. – Т. 26, № 6. – С. 587-594.

2. Высоцкий, В.А. Клональное микроразмножение плодовых растений и декоративных кустарников / В.А. Высоцкий // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве. − Мичуринск, 1989. − С. 3-8.

3. Высоцкий, В.А. Регенерация плодовых и ягодных растений в культуре каллусной ткани, пыльников, листовых и стеблевых эксплантов / В.А. Высоцкий // Садоводство и виноградарство. – 2008. – № 2. – С.17-20.

4. Расторгуев, С.Л. Культура изолированных тканей и органов в селекции плодовых растений / С.Л. Расторгуев. – Мичуринск: изд-во МичГАУ, 2009. – 170 с.

5. Yae, B.W. Influence of photoperiod, apical meristem and explants orientation on axillary shoot proliferation of apple cultivars in vitro / B.W. Yae, R.H. Zimmerman, I. Fordham, K.S. Ko // J. Amer. Soc. Hort. Sci. – 1987. – V. 112, № 3. – Р. 588-592.