Медицина

УДК 579:612.112.94

Назаренко Р.В.

Луганский государственный медицинский университет

Изучение влияния бактериальных эндотоксинов на систему циклических нуклеотидов Т-лимфоцитов крови in vitro

Актуальность темы. Гнойно-воспалительные осложнения в хирургической патологии обусловлены выраженными сдвигами в состоянии основных защитных систем организма: иммунитета, гемостаза, неспецифической резистентности организма [1]. Имеющиеся в научной литературе сведения об иммуносупрессивном воздействии структурных компонентов бактерий на отдельные популяции иммунокомпетентных клеток убедительно демонстрируют негативную роль пептидогликана (ПГН), липополисахарида (ЛПС) и тейхоевых кислот (ТК) разных видов бактерий в формировании иммунодефицитного состояния [2, 6]. Известно, что изменение уровня циклических нуклеотидов может вызывать модуляцию различных реакций иммунокомпетентных клеток [1-5]. С этой точки зрения представляло интерес целенаправленное изучение состояния системы циклических нуклеотидов в нейтрофилах и моноцитах под влиянием структурных компонентов бактерий – липополисахаридов (ЛПС) и пептидогликанов (ПГН) [4, 5].

Цель работы. Изучить влияние бактериальных эндотоксинов на систему циклических нуклеотидов Т-лимфоцитов крови человека in vitro.

Материал и методы исследования. Определение содержания аденозина фосфатов (АТФ, АДФ и АМФ) в нейтрофилах и моноцитах проводили методом тонкослойной хроматографии с использованием пластин «Силуфол» [3]. К 1 мл выделенным и трижды отмытым в течение 20 минут холодным изотоническим раствором натрия хлорида при скорости 3000 оборотов в минуту нейтрофилам и моноцитам добавляли 1 мл раствора хлорной кислоты, перемешивали и через несколько минут осадок отделяли центрифугированием. К 1 мл надосадочной жидкости прибавляли 0,1 мл раствора калия карбоната и оставляли на холоде, пока полностью не выпадут кристаллы образовавшегося перхлората калия. 0,05-0,1 мл холодной надосадочной жидкости наносили в виде полоски на пластину «Силуфол» и проводили восходящую хроматографию в течение 60-90 минут в смеси диоксана, изопропилового спирта и аммиака. Вынутые из камеры пластины высушивали на воздухе и просматривали в коротком ультрафиолетовом свете на ультрахемоскопе Блюмберга, находили пятна нуклеотидов и обводили их острым предметом. Порошок с отмеченных мест пластины соскабливали и элюировали 3 мл 0,1 N HCl, после чего определяли светопоглощение надосадочной жидкости при длине волны 260 нм. Расчёт проводили исходя из молярных коэффициентов экстинции.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате проведенного исследования было установлено, что контакт in vitro бактериальных эндотоксинов (ТК, ПГН S. haemolyticus и ЛПС B. merdae) в действующей концентрации 100 мкг/мл вызывает негативные изменения в системе циклических нуклеотидов, как CD4+-лимфоцитов, так и CD8+-лимфоцитов периферической крови человека. Выявленные нарушения в указанных субпопуляциях Т-лимфоцитов были неодинаковы по своей направленности. А именно, под воздействием бактериальных эндотоксинов в субпопуляции CD4+-лимфоцитов внутриклеточная концентрация цАМФ увеличивалась, а внутриклеточная концентрация цГМФ - снижалась, что сопровождалось повышением коэффициента цАМФ/цГМФ. В субпопуляции CD8+-лимфоцитов под влиянием бактериальных эндотоксинов происходило увеличение внутриклеточных концентраций и цАМФ, и цГМФ, что сопровождалось снижением коэффициента цАМФ/цГМФ. Также было установлено, наибольшее негативное влияние на систему циклических нуклеотидов CD4+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов оказывали ЛПС B. merdae, умеренное – ПГН S. haemolyticus, наименьшее – ТК S. haemolyticus.

Результаты исследования влияния бактериальных эндотоксинов на систему циклических нуклеотидов субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови человека in vitro представлены в таблице 1.

Таблица 1. Влияние бактериальных эндотоксинов (100 мкг/мл) на систему циклических нуклеотидов CD4+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов in vitro

Показатель	Референт-ная норма (n=33)	Действие ТК (n=20)	Действие ПГН (n=20)	Действие ЛПС (n=20)
CD4+-лимфоциты
цАМФ, пмоль/6 lg клеток	1,62±0,14	2,15±0,11**	2,36 ±0,12***	2,63 ±0,13***
цГМФ, пмоль/6 lg клеток	2,62±0,13	2,19±0,11*	2,03 ±0,10***	1,87 ±0,09***
цАМФ/цГМФ, у.е.	0,62±0,03	0,98 ±0,05***	1,16 ±0,06***	1,40 ±0,07***
CD8+-лимфоциты
цАМФ, пмоль/6 lg клеток	4,42±0,22	5,06±0,25	5,21±0,26*	5,43 ±0,27**
цГМФ, пмоль/6 lg клеток	0,94±0,05	1,12±0,06*	1,23 ±0,06***	1,36 ±0,07***
цАМФ/цГМФ, у.е.	4,70±0,23	4,51±0,23	4,24±0,21	3,99±0,20*

Примечание. * - р<0,05; **- р<0,01; ***- р<0,001 относительно референтной нормы.

Как следует из приведенных в табл. 1 данных, наименьшее отрицательное влияние на систему циклических нуклеотидов CD4+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов оказывали ТК S. haemolyticus. Под их влиянием внутриклеточное содержание цАМФ в CD4+-лимфоцитах в конце опыта оказалась в 1,33 раза выше соответствующего показателя референтной нормы (р<0,01), тогда как внутриклеточная концентрация цГМФ была в 1,20 раза ниже референтной нормы, что также было статистически достоверным. Указанные разнонаправленные изменения уровней цАМФ и цГМФ в CD4+-лимфоцитах сопровождались увеличением коэффициента цАМФ/цГМФ против показателя референтной нормы в 1,58 раза, что свидетельствовало о преобладании в CD4+-лимфоцитах цАМФ над цГМФ (р<0,001).

Изменения в системе циклических нуклеотидов в CD8+-лимфоцитах под влиянием ТК S. haemolyticus были следующими.

Как оказалось, под влиянием ТК внутриклеточная концентрация цАМФ в CD8+-лимфоцитах в конце опыта, составляя в среднем 5,06±0,25 пмоль/6 lg клеток, оказалось выше аналогичного показателя референтной нормы в 1,14 раза, что статистически значимым не являлось. В то же время, внутриклеточное содержание цГМФ в CD8+-лимфоцитах возросло против соответствующей референтной нормы в 1,19 раза (р<0,05). Вследствие указанных сдвигов внутриклеточных концентраций фракций циклических нуклеотидов происходило несущественное снижение коэффициента цАМФ/цГМФ (в 1,04 раза). Данное обстоятельство позволяло предположить, что субпопуляция CD8+-лимфоцитов более резистентна к воздействию ТК S. haemolyticus, чем субпопуляция CD4+-лимфоцитов.

В целом, полученные результаты исследования показали, что непосредственный контакт ТК S. haemolyticus с CD4+-лимфоцитами и CD8+-лимфоцитами периферической крови человека вызывают в указанных клетках сдвиги в их системе циклических нуклеотидов.

Более выраженные изменения в системе циклических нуклеотидов развивались в субпопуляциях Т-лимфоцитов после их контакта с ПГН S. haemolyticus. Так, вследствие взаимодействия ПГН с культурами CD4+-лимфоцитов, в последних происходило увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ относительно референтной нормы в 1,46 раза (р<0,001). При этом абсолютный показатель уровня цАМФ был в 1,1 раза выше аналогичного показателя в опытах с CD4+-лимфоцитами и ТК (р>0,05), что свидетельствовало о более значительном негативном влиянии ПГН, по сравнению с таковым для ТК.

Наряду с этим, под влиянием ПГН S. haemolyticus внутриклеточная концентрация цГМФ в CD4+-лимфоцитах в конце эксперимента оказалась ниже показателя референтной нормы в 1,29 раза, а также в 1,08 раза ниже концентрации цГМФ в CD4+-лимфоцитах, взаимодействовавших с ТК (р<0,001 и р>0,05, соответственно).

Вследствие разнонаправленных изменений в CD4+-лимфоцитах внутриклеточных концентраций цАМФ и цГМФ, вызванных влиянием ПГН, коэффициент цАМФ/цГМФ увеличивался, против показателя референтной нормы, в 1,87 раза (р<0,001). При этом абсолютное значение зарегистрированного коэффициента цАМФ/цГМФ оказалось также в 1,18 раза выше такового в опытах с CD4+-лимфоцитами и ТК (р<0,05).

Изменения в системе циклических нуклеотидов CD8+-лимфоцитов были следующими. Под влиянием ПГН S. haemolyticus внутриклеточный уровень цАМФ, составив в среднем 5,21±0,26 пмоль/6 lg клеток, оказался в CD8+-лимфоцитах в конце опыта в 1,18 раза выше показателя референтной нормы, а также в 1,03 раза выше уровня цАМФ в CD8+-лимфоцитах, подвергнутых воздействию ТК (р<0,05 и р>0,05, соответственно).

Вместе с тем, внутриклеточное содержание цГМФ в CD8+-лимфоцитах, контактировавших с ПГН, в конце опыта оказалось выше аналогичного показателя референтной нормы в 1,31 раза и в 1,1 раза выше, чем это имело место в опытах с CD8+-лимфоцитами и ТК (соответственно р<0,001 и р>0,05).

В результате указанных изменений внутриклеточных концентраций цАМФ и цГМФ, интегральный коэффициент цАМФ/цГМФ для культур CD8+-лимфоцитов, взаимодействующих с ПГН S. haemolyticus, оказался ниже референтной нормы в 1,11 раза (р>0,05), а также в 1,06 раза ниже, чем это имело место в опытах с CD8+-лимфоцитами и ТК (р>0,05).

Таким образом, ПГН S. haemolyticus при непосредственном контакте in vitro с CD4+-лимфоцитами и CD8+-лимфоцитами периферической крови человека вызывают в указанных клетках выраженные изменения в системе циклических нуклеотидов, которые превосходят таковые, отмеченные в аналогичных субпопуляциях Т-лимфоцитов под воздействием ТК S. haemolyticus.

Наиболее значительные изменения в системе циклических нуклеотидов были зарегистрированы в субпопуляциях CD4+- и CD8+-лимфоцитов, подвергшихся воздействию ЛПС B. merdae.

Так, при непосредственном контакте с ЛПС в дозе 100 мкг/мл внутриклеточная концентрация цАМФ в конце эксперимента в CD4+-лимфоцитах, составляя в среднем 2,63±0,13 пмоль/6 lg клеток, оказалась выше аналогичного показателя референтной нормы, в 1,62 раза выше (р<0,001). Кроме того, указанный показатель был в 1,22 раза выше, чем в опытах с CD4+-лимфоцитами и ПГН, а также в 1,11 раза выше, чем в опытах с CD4+-лимфоцитами и ТК (р<0,05 и р>0,05, соответственно).

В отличие от цАМФ, внутриклеточное содержание цГМФ в CD4+-лимфоцитах, взаимодействующих с ЛПС B. merdae, оказалось сниженным относительно референтной нормы в 1,40 раза, составляя в среднем 1,87±0,09 пмоль/6 lg клеток (р<0,001). Приведенный показатель был также в 1,09 и в 1,17 раза выше подобных показателей для CD4+-лимфоцитов в опытах с ПГН и ТК соответственно (р<0,05 и р>0,05).

Интегральный коэффициент цАМФ/цГМФ для культур CD4+-лимфоцитов, контактировавших с ЛПС B. merdae, в конце эксперимента оказался увеличенным относительно референтной нормы в 2,26 раза (р<0,001), а против аналогичных показателей для CD4+-лимфоцитов, контактировавших с ПГН и ТК – увеличенным в 1,21 и в 1,43 раза, соответственно (в обоих случаях различия статистически значимы).

Таким образом, ЛПС B. merdae вызывали наиболее выраженные сдвиги в системе циклических нуклеотидов CD4+-лимфоцитов.

Изменения в системе циклических нуклеотидов в субпопуляции CD8+-лимфоцитов в присутствии ЛПС были следующими.

Как оказалось, под влиянием ЛПС B. merdae внутриклеточная концентрация цАМФ в CD8+-лимфоцитах возросла против аналогичного показателя референтной нормы в 1,23 раза, а также оказалась в 1,04 и в 1,07 раза выше подобных показателей для CD8+-лимфоцитов, контактировавших соответственно с ПГН и ТК, что, однако, статистически значимым не являлось.

В тоже время, внутриклеточное содержание цГМФ в CD8+-лимфоцитах, взаимодействовавших с ЛПС B. merdae, в конце эксперимента, составляя в среднем 1,36±0,07 пмоль/6 lg клеток, оказалось в 1,45 раза выше показателя референтной нормы, а также в 1,11 и в 1,21 раза выше концентраций цГМФ в CD8+-лимфоцитах, контактировавших с ПГН и ТК (соответственно, р<0,001, р>0,05 и р<0,05).

Вследствие разнонаправленности изменений внутриклеточных концентраций цАМФ и цГМФ в CD8+-лимфоцитах, вызванных ЛПС, наблюдалось увеличение интегрального коэффициента цАМФ/цГМФ, который, составив в среднем 3,99±0,20 пмоль/6 lg клеток, относительно показателя референтной нормы оказался ниже в 1,18 раза (р<0,05).

Кроме того, зарегистрированное среднее значение коэффициента цАМФ/цГМФ в анализируемом эксперименте было в 1,06 и в 1,13 раза ниже, чем аналогичные коэффициенты, зарегистрированные в опытах с CD8+-лимфоцитами и ПГН, и ТК (соответственно р>0,05 и р<0,05).

Выводы. Таким образом, приведенные результаты исследования свидетельствуют о том, что бактериальные эндотоксины (ТК, ПГН S. haemolyticus и ЛПС B. merdae) при их непосредственном контакте с CD4+-лимфоцитами и CD8+-лимфоцитами периферической крови человека существенно влияют на систему циклических нуклеотидов указанных клеток. Под воздействием ТК, ПГН и ЛПС в субпопуляции CD4+-лимфоцитов происходит увеличение внутриклеточной концентрации цАМФ и снижение внутриклеточной концентрации цГМФ, что сопровождается увеличением коэффициента цАМФ/цГМФ. В субпопуляции CD8+-лимфоцитов указанные ранее бактериальные эндотоксины вызывают увеличение внутриклеточного содержания, как цАМФ, так и цГМФ. Наиболее значительные изменения в системе циклических нуклеотидов CD4+-лимфоцитов и CD8+-лимфоцитов вызывали ЛПС B. merdae, тогда как наименее выраженные сдвиги имели место под влиянием ТК S. haemolyticus. По сравнению с CD4+-лимфоцитами, CD8+-лимфоциты при взаимодействии с бактериальными эндотоксинами реагировали менее значительными изменениями внутриклеточных концентраций цАМФ и цГМФ, и менее выраженным дисбалансом между ними.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Белобородов В.Б. Клинико-лабораторное обоснование и практика лечения тяжелых инфекций, вызванных стафилококками / В.Б. Белобородов // Инфекции в хирургии – 2011. – № 4. – С. 14-19.

2. Васильев Н.В. Биохимия и иммунология микробных полисахаридов / Н.В. Васильев, Н.Б. Луцюк, Г.К. Палий, О.В. Смирнова - Томск: Издательство Томского университета, 1984. –304 с.

3. Евгеньев М.И. 5-Хлор-4,6-динитробензофуразан как реагент в тонкослойной хроматографии ароматических аминов / М.И. Евгеньев, И.И. Евгеньева, Н.А. Москва, Ф.С. Левинсон // Завод. лаб., 1992. – Т. 58, № 4. – С. 11-13.

4. Стериони И.В. Влияние липополисахаридов и пептидогликанов на систему циклических нуклеотидов нейтрофилов и моноцитов in vitro / И.В. Стериони // Загальна патологія та патологічна фізіологія. – 2008. – № 1. – С. 60-65.

5. Татаров С.В. Влияние пептидогликанов и тейхоевых кислот этиологических агентов хронического остеомиелита на систему циклических нуклеотидов и фагоцитарную активность моноцитов in vitro / С.В. Татаров // Український медичний альманах. – 2003. – № 6. – С. 215-218.

6. Ivanova S.A. Spontaneous and in vitro induced apoptosis of lymphocytes and neutrophils in patients with alcohol dependence / S.A. Ivanova, N.M.Vyalova, E.V. Zhernova, N.A. Bokhan //Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2010. – Т. 149, № 2. –С. 246-249.