Принципы, преимущества и разновидности полимеразной цепной реакции

Бахытова Т.Б., Погосян Г.П.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) в биологическом материале (пробе).[1]

С помощью данного метода в течение нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность получения огромного количества копий одного строго определённого участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.[2]

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) изобрёл в 1983 году американский учёный Кэри Бенкс Мюллис. Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию в области химии.[3]

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуального обнаружения. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Кроме простого увеличения числа копий ДНК (амплификация), полимеразная цепная реакция позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом: введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК и т.п. Широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных и инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций и выделения новых генов. В биотехнологии ПЦР широко используется для получения большого количества специфических последовательностей ДНК для различного применения: создание зондов, векторов, чипов, молекул ДНК заданной геометрической формы и т.д.[4]

Метод ПЦР обладает рядом существенных преимуществ по сравнению со многими другими видами лабораторной диагностики. Ниже представлен их перечень.

· Универсальность - метод принципиально позволяет обнаруживать любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно;

· Высокая специфичность - обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент нуклеотиновой последовательности, характерный только для данного возбудителя или гена;

· Высокая чувствительность - возможность проведения не только качественной, но и количественной оценки содержания НК;

· Высокая скорость получения результата - высокая технологичность и автоматизация метода позволяет провести исследования и получить результат в рамках одного дня;

· Возможность доклинической и ретроспективной диагностики - ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в организме ещё до развития заболевания;

· Проведение анализа при минимальном объеме пробы - возможно проведение ПЦР в пробе, объемом до нескольких микролитров, что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.;

· Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба качеству результата;

· Исключение возможности инфицирования персонала - в процессе проведения ПЦР возможность инфицирования персонала исключается, т.к. материал дезинфицируется лизисом и высокой температурой;

· Прямое определение наличия возбудителей;

· Возможность диагностики острых, вялотекущих и скрытых инфекций;

· Возможность экспертизы - фотографии электрофореза, а также отчеты по результатам ПЦР сохраняются в электронном варианте.[5]

Существует множество специализированных разновидностей ПЦР предназначенных для решения специальных задач, а также количественные варианты ПЦР, из которых в настоящее время широко используется ПЦР в реальном времени (Quantitative Real time PCR).[6]

Рассмотрим следующие разновидности полимеразной цепной реакции:

1) Hot - start PCR - для повышения специфичности реакции

2) Touch - down PCR - для повышения специфичности реакции

3) Allele - specific PCR - для выявления однонуклеотидных различий

4) RT - PCR (reverse transcriptase PCR) - для амплификации РНК

5) Asymmetric PCR - для получения одноцепочечного продукта ДНК

6) Real-time PCR, qPCR - для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК

7) Inverse PCR - если известна небольшая последовательность внутри амплифицируемого участка

8) Nested PCR - для проведения двух последовательных реакций (повышения чувствительности и специфичности)

9) PCR mutagenesis - если известны два направленного внесения заменяющих последовательность[7]

1. Hot - start PCR (горячий старт) и 2. Touch - down PCR (и ступенчатая ПЦР)

Высокая специфичность полимеразной цепной реакции обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной последовательностью праймеров, что не дает возможность получения ложных результатов в отличие от метода иммуноферментного анализа, где встречаются ошибки в связи с перекрестно - реагирующими антигенами. Методика, которая снижает неспецифическую амплификацию во время начальной настройки этапов ПЦР.[8]

3. Allele - specific PCR (аллель - специфичная ПЦР)

Аллельные варианты различаются за счёт того, что 3' концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с позицией однонуклеотидных полиморфизмов. Степень дискриминации можно увеличить, вводя дополнительный, неспаренный нуклеотид во второй или третей позиции с 3' конца этого же праймера. Ещё один способ повышения специфичности - проведение в той же пробирке конкурирующей ПЦР реакции.[9]

4. RT - PCR (ПЦР с обратной транскрипцией)

В случае если анализируется молекула РНК, а не ДНК, используется ПЦР с обратной транскрипцией. При этом выделяют РНК, из нее с помощью фермента обратной транскриптазы (ревертазы) получают к - ДНК, с которой уже проводят ПЦР. Это удобно в экспериментах по определению того, какие именно гены в данной клетке экспрессируются.[10]

5. Asymmetric PCR (асимметричная ПЦР)

Выполняется в том случае, когда нужны продукты амплификации преимущественно одной из двух цепей ДНК. Для этого необходимо добавлять неравное количество праймеров. Сама ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке. Используется в некоторых методиках секвенирования ДНК и гибридизационного анализа.[11]

6. Real - time PCR или qPCR (количественная ПЦР в реальном времени)

В реакции используются флуоресцентно меченые реагенты и специальный прибор (амплификатор), который рассматривает пробирку и сообщает о концентрации продукта. Ее принципиальной особенностью является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, автоматической регистрации и интерпретации полученных результатов. Также кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество. Эта модификация ПЦР позволяет следить за накоплением ампликонов «в реальном времени».

7. Inverse PCR (“Инвертированная” ПЦР)

Перед проведением ПЦР с помощью серии ферментативных реакций как бы приклеивают известные фрагменты на концы неизвестного, чтобы можно было его амплифицировать. Такая разновидность ПЦР используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами.[12]

8. Nested PCR (“вложенная или гнездовая ПЦР”)

Применяется для уменьшения числа побочных продуктов также для повышения чувствительности и специфичности реакции. Используется вторая пара праймеров, которая амплифицирует отрезок полученного фрагмента, реакцию проводят в два этапа. Вложенная ПЦР часто наиболее успешна в специфической амплификации длинных фрагментов ДНК, чем традиционная ПЦР, но она требует более подробных знаний о последовательностях-мишенях.[13]

9. PCR mutagenesis (“мутагенная ПЦР”)

Полимеразная цепная реакция позволяет проводить сайт, направленный на мутагенез с использованием пары праймеров, вызывающая мутацию, а также случайный мутагенез. В последнем случае ошибки в последовательность ДНК вносятся полимеразой в условиях, понижающих ее специфичность.[14]

Таким образом, каждая из рассмотренных разновидностей полимеразной цепной реакции используются в конкретных экспериментах. Модификации ПЦР - анализа дают определенные возможности для проведения реакций. Преимущества их зависят от факторов, в которых проводится работа и преследуемой цели для получения необходимого продукта.[15]

Литература

1. Mulis K.B., Ferre F. The polymerase chain reaction//Birkhauser, Boston, Mass. - 1994. P. 241 - 255.

2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. - М.: Мир, 2002. - 589 с.

3. Жимулев И.Ф. Общая молекулярная генетика. - Новосибирск: Сибирское университетское издание, 2003. – 478 с.

4. Жданов А.В., Малинина Э.В., Файзуллин Л.З. Выявление хламидий методом полимеразной цепной реакции при патологиях репродуктивной системы мужчин и женщин//Бюллетень экспериментальной биологии. - 1996. - №5. - С.547. - 550.

5. Погосян Г.П., Коновалова А.А., Головченко Н.М., Манасян А.Р., Ли П.К. Полимеразная цепная реакция (принципы, возможности) // Известия НАН РК. - Серия Биологическая и медицинская. - 2011. - №5. - С. 60-72.

6. Bosch F.X., Manos M.M. and Munoz N. Prevalence of HPV in cervical cancer: a World Wide perspective // J. of the National Cancer Institute.-1995.-Vol.87.-P.796-802.

7. Zur Hausen H. and de Villiers E.M. Human papillomavirus // Annual Reviews in Microbiology.-1994.-V.48.-P.427-447.

8. H.R. Mc Murray, D. Nguyen, T.F. Westbrook et al, Biology of human papillomaviruses // Int. J. of Exp. Path.-2001.–Vol.82.-P.15-33.

9. Radich J. P., Gehly G., Gooley T., Bryant E., Clift R. A., Collins S., Edmands S., Kirk J., Lee A., Kessler P., Schoch G., Buckner C. D., Sullivan K. M., Appelbaum F. R., Thomas E. D. Polymerase Chain Reaction Detection of the BCR-ABL Fusion Transcript After Allogeneic Marrow Transplantation for Chronic Myeloid Leukemia: Results and Implications in 346 Patients//Blood. - 1995. - Vol. 85(9). - P. 2632-8.

10. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. - Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. - 496 с.; илл. - ISBN 5 - 94087 - 098 - 8.

11. Lysov, I.U., V.L. Florent'ev, A.A. Khorlin, K.R. Kharpko, and V.V. Shik. 1988. Determination of the nucleotide sequence of DNA using hybridisation with oligonucleotides.

12. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Science 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350 - 4; Enzymatic amplification of beta - globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.

13. Venter J, et al. (2001) «The sequence of the human genome». Science 291 (5507): 1304-51.

14. Syvanen, A - C., E. Ikonen, T. Manninen, M. Bengstrom, H. Soderlund, P. Aula, and L. Peltonen.1992. Convenient and quantitative detection of the frequency of the mutant allele using solid-phase minisequencing: application to aspartylglucosaminuria in Finland. Genomics 12:590 - 595.

15. Каледин А. С., Слюсаренко А. Г., Городецкий С. И. // Биохимия.