Сураганова Д.А., Турпанова Р.М.

Евразийский национальный университет имени Л.Н. Гумилева, г. Астана

ПОЛУЧЕНИЕ ВЕКТОРА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНОГО сосудистого эндотелиального фактора роста В КЛЕТКАХ E.COLI

В 1983 году Сенгером был открыт в клеточной линии карциномы фактор сосудистой проницаемости эндотелиальных клеток, особенно, им оказалась богата асцидная жидкость опухоли [1]. Поэтому он получил название сосудистый фактор проницаемости (VPF). Другими исследователями был охарактеризован фактор ответственный за ангиогенез получивший название VEGF. В последствии было установлено, что VEGF и VPF идентичны. VEGF является мультифункциональной молекулой, обладающей разнообразным спектром биологической активности зависящей от стадии развития и физиологической функции органа в котором он экспрессируется [2].

VEGF (vascular endothelial growth factor) - cосудистый эндотелиальный фактор роста - семейство структурно близких между собой белков:VEGF-A, -B, -C, -D, -E и плацентарного ростового фактора (placenta growth factor, PlGF) [3]. Эти биологически активные белки влияют на развитие кровеносных сосудов и обладают общей структурной архитектурой, несмотря на малую степень гомологии первичных последовательностей. Они имеют общую структуру цистеинового узла [4].

VEGF-А является наиболее мощным и основным регулятором ангиогенеза и васкулогенеза.VEGF-А, высоко специфичным митогеном для сосудистых эндотелиальных клеток, способствующий высвобождению белков из кровеносных сосудов, ассоциированных с опухолью.

VEGF-А существует в восьми изоморфных формах:VEGF₁₂₁, VEGF₁₄₅, VEGF₁₄₈, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₃, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆, образуемых в результате альтернативного сплайсинга мРНК, которая состоит из 8-ми экзонов. Эти изоформы отличаются в способности связывать гепарин- и гепаран-сульфат.

Изоформа VEGF₁₆₅ была первой идентифицированным членом семейства васкулярных эндотелиальных факторов роста. VEGF₁₆₅ является основным сосудистым эндотелиальным фактором роста в человеческих тканях. VEGF₁₆₅ транскрибируется в виде 191 членного полипептида, но затем сигнальные 25 первых аминокислотных остатка специфически отщепляются протеиназой. Зрелый белок состоит из 165 аминокислотных остатка первые 115 участвуют в образовании цистеинового узла и ответственны за связывание с рецептором. С концевые 25 аминокислотных остатка не участвуют в рецепторном взаимодействии, а несут сайты аффиности к гепарину [5].

Аминокислотная последовательность был взята из статьи Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors. Nat Med. 2003 Jun;9(6):669-76. [37]. Последовательность представлена на рис.8.

Оптимизация кодонов последовательности гена VEGF 165 для эффективной прокариотическиой экспрессии была проведена в соответствии с данными, представленными в базе данных "Codon-Usage Database" для Escherichia coli [http://www.kazusa.or.jp/codon/]

Синтез искусственного гена VEGF₁₆₅ осуществляли химико-ферментативным способом из перекрывающихся олигонуклеотидов, составляющих структуру цепей полинуклеотидного дуплекса. Ниже приведена схема расположения и нумерация олигонуклеотидов (Рис.1).

Рис.1 Схема синтеза искусственного гена VEGF₁₆₅

Предварительно нами было проведено ферментативное фосфорилирование полинуклеотидкиназой фага Т4 олигонуклеотидов за исключением концевых V-1 и V-15. Последующим отжигом и лигированием ДНК-лигазой фага Т4 олигонуклеотидов (V-1 – V-28), получили искусственный ген VEGF₁₆₅.

Амплификацию лигазной смеси проводили при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами PR-1 и PR-2, содержащими сайты рестриктаз NcoI и XhoI соответственно. Очистка ПЦР-продукта осуществлялась с помощью набора MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, #27106) (Рис 2).

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР. Дорожка №1 t отжига праймеров 60^оC Дорожка №2 t отжига праймеров 58^оC

В качестве экспрессионного вектора был выбран плазмидный вектор pET-23d(+). Данный вектор содержит в полилинкерной последовательности сайты рестрикции NcoI (ccatgg) и XhoI (ctcgag), по которым и была произведена вставка амплифицированного гена VEGF165 с учетом корректной рамки считывания (Рис.3)

Рис.3 а) Схема получения плазмиды pER VEGF₁₆₅; б) Полилинкерная последовательность плазмиды pET23d(+)

После расщепления эндонуклеазами рестрикции NcoI и XhoI вектор лигировали с очищенным продуктом ПЦР, обработанным теми же рестриктазами. В результате чего была получена рекомбинантная плазмида pER VEGF₁₆₅.

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.coli ER2566. Суспензию трансформированных клеток рассевали на чашки с селективной средой. Клоны, полученные при высевании трансформированных клеток на агаризованную среду с добавлением ампициллина, пересевали в жидкую среду с добавлением ампициллина для выращивания и отбора рекомбинантов.

Отбор рекомбинантов осуществляли по результатам электрофореза клеточных лизатов клонов в ПААГ представленного на рис. 12.

Рис.12 Электрофореграмма суммарных клеточных лизатов различных клонов. Номер дорожки на геле соответствует номеру клона. №1- маркер масс.

Для последующей работы были отобраны клоны №2, №3, №4. Выделение плазмиды для последующей трансформации компетентных клеток E.сoli ER2566 осуществлялось из отобранных клонов с помощью набора Promega (по протоколу производителя). Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы по методу Сенгера (в компании Евроген). Анализ нуклеотидной последовательности плазмиды pER VEGF₁₆₅ подтвердил правильность вставки гена VEGF₁₆₅.

В результате проведенной работы был осуществлен химико-ферментативный синтез гена белка VEGF₁₆₅, и клонирование его в экспрессирующий вектор pET23d(+). Получен высокоэффективный штамм-продуцент E.coli (ER2566)/pERVEGF₁₆₅, продуцирующий рекомбинантный сосудистый эндотелиальный фактор роста.

Литература

1. Senger, D. R., Galli, S. J., Dvorak, A. M., Perruzzi, C. A., Harvey, V. S., and Dvorak, H. F. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 1983, 219: 983–985

2. Grunewald M, Avraham I, Dor Y, Bachar-Lustig E, Itin A, Yung S, Chimenti S, Landsman L, Abramovitch R, Keshet E. VEGF-induced adult neovascularization: recruitment, retention, and role of accessory cells. Cell. 2006, 124(1): 175–189.

3. Otrock, Z. K., Makarem, J. A., and Shamseddine, A. I. Vascular endothelial growth factor family of ligands and receptors: review. Blood Cells Mol. Dis. 2007, 38: 258–268.

4. Shalini Iyer and K. Ravi Acharya. Tying the knot. The cystine signature and molecular-recognition processes of the vascular endothelial growth factor family of angiogenic cytokines. FEBS Journal. 2011, 278: 4304–4322.

5. Ferrara N. Binding to the extracellular matrix and proteolytic processing: two key mechanisms regulating vascular endothelial growth factor action, Mol. Biol. Cell. 2010, 21: 687–690.