Мотроненко В.В.

Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського»

Вплив перемішування на рекомбінантні бактерії при глибинному культивуванні

Розвиток біотехнології пов'язаний з використанням рекомбінантних мікроорганізмів в які вживлена чужорідна ДНК, що відповідає за синтез певного метаболіту. Використання цієї технології дало можливість створювати продуценти синтезу багатьох біологічно активних речовин, а також отримувати продуктів з покращеними властивостями, або в більшій кількості. Завдяки наявність в рекомбінантних штамах чужорідної ДНК збільшується їх чутливість до умов культивування, в першу чергу до швидкості перемішування, як лімітуючого фактору процесу.

Вплив режимів перемішування на продуктивність і життєздатність рекомбінантних бактерій проводилися вченими багатьох країн світу. Зробивши аналіз отриманих ними результатів, ми прийшли до висновку, що у випадку з рекомбінантними мікроорганізмами необхідно дотримуватися більш бережних режимів проведення процесу, ніж при культивуванні не рекомбінантних штамів. У якості прикладу, для підтвердження своїх висновків розглянемо деякі роботи.

При дослідженні впливу перемішування та аерації на синтез рекомбінантним штамом Escherichia coli SGK25/pIF TREN α2-інтенферону досліди проводилися для трьох випадків: при змінній інтенсивності аерації та швидкості перемішування, при змінній аерації і постійній швидкості перемішування, при постійній аерації та змінній швидкості перемішування. Під час експерименту, швидкість перемішування змінювали в межах від 50 об/хв до 400 об/хв. Найбільше біомаси накопичувалося при постійній аерації та інтенсивності перемішування 200 об/хв, а от максимальний вихід метаболіту спостерігався при постійній інтенсивності аерації та швидкості перемішування 400 об/хв.

При глибинному культивуванні рекомбінантних Bacillus licheniformis NCIM-2042 досліди проводили для швидкості перемішування 200, 300 та 400 об/хв, а також для трьох різних значень інтенсивності аерації. Максимальний вихід ферменту протеази спостерігався при швидкості перемішування 300 об/хв. Відхилення від цієї величини, як в меншу (до 200 об/хв), так і в більшу (до 400 об/хв) сторону, негативно впливало на синтез ферменту та накопичення біомаси. Але, якщо збільшити інтенсивність аерації, то максимальний вихід протеази спостерігатиметься при 200 об/хв.

Коли розглянути вплив перемішування на синтез амінокислоти L-фенілаланін іншим рекомбінантнимштамом Escherichia coli BL21, максимальний вихід продукту спостерігатиметься при 400 об/хв. Збільшення кількості накопиченої біомаси і синтезованої амінокислоти спостерігатиметься при швидкості перемішування що знаходиться в діапазоні від 200 до 400 об/хв. Подальше збільшення частоти обертання мішалки до 500 об/хв призведе до зниження показників виходу цільового продукту.

Досліди по впливу перемішування на синтез біотину в процесі глибинного культивування рекомбінантних Sphingomonas paucimobilisp SP304 проводили при частоті обертання перемішуючого пристрою в межах від 200 об/хв до 800 об/хв, з використанням різних конструкцій мішалок. При 200 та 800 об/хв не спостерігалося ніяких ознак росту клітин та синтезу вітаміну. Найвища концентрація біомаси утворювалася при 600 об/хв, а от максимальний вихід біотину спостерігався при 400 об/хв. На основі отриманих результатів, автори прийшли до висновку, що цепов'язано з напруженнями зсуву які виникали в клітинах мікроорганізмів. Аналогічні результати отримали і при використанні різних типів мішалок. Максимальний приріст біомаси спостерігався при 600 об/хв не залежно від типу робочого колеса. А от синтез біотину при використанні якірної мішалки був максимальним при 200 об/хв, а для турбінної мішалки та мішалки конструкції Maxblend^® - при 400 об/хв.

Також, було встановлено, що зовнішня будова клітин залежить від умов культивування. Провівши мікроскопічний аналіз культуральної рідини після 120 годин культивування отримали, що при 200 об/хв розміри клітин були більшими ніж в решті випадків. Клітини бактерій мали овальну форму при низьких обертах мішалки (200 - 600 об/хв) та видовжену форму при виоких (800 об/хв) у випадку, використання турбінної мішалки. Видовження клітин, також спостерігалося при використанні пропеллерної мішалки при 400 об/хв і більше. В обох випадках, коли клітини мали видовжену форму, знижувався рівень біотину, який синтезувався клітинами рекомбнантних бактерій.

Із сказаного вище ми бачимо, що швидкість перемішування, як ми і передбачували, має вагомий вплив при глибинному культивуванні рекомбінантних бактерій. Також вагомий вплив має співвідношення між швидкістю перемішування, інтенсивністю аерації та складом поживного середовища. При культивуванні рекомбінантних бактерій оптимальна частота перемішування, за літературними даними, яку можна використовувати в промислових умовах, складає 150-400 об/хв. Але максимальна кількість накопиченої біомаси не завжди відповідає максимальному рівню синтезу метаболітів, а на процеси накопичення біомаси і синтезу метаболітів впливає не лише швидкість обертання перемішуючого пристрою, а й конструкція мішалки, що використовуються в процесі.

Було встановлено, що у більшості розглянутих випадків, клітини не отримують достатньою кількістю кисню, що надходить до них, при низьких частотах обертання мішалки, та механічним пошкодженням клітин - при високих. Тому, оптимальна швидкість перемішування в першу чергу залежить від культури, що використовується в якості продуценту. Для рекомбінантних бактерій, спостерігається негативний вплив напружень зсуву, що виникають в клітинах при великих швидкостях перемішування. Це призводить до зниження рівня синтезу метаболітів та кількості накопиченої біомаси, та викликає необхідність в проведенні подальших досліджень та детальному вивченні механізмів що зумовлюють виникнення зазначеного явища.