Экология/4. Промышленная экология и медицина труда

К.м.н. Сиренко Е.В., к.м.н. Кучеренко Э.А.

Харьковская медицинская академия последипломного образования, кафедра клинической лабораторной диагностики, Украина.

Влияние субтоксических доз многокомпонентных органических смесей на основе гликолей на состояние белков клеточной мембраны

В настоящее время антропогенная нагрузка на жителей крупных населенных пунктов постоянно возрастает, в том числе, в результате увеличения объемов и наименований продуктов органической химии, к которым относятся и многокомпонентные органические смеси, синтезированные на основе гликолей (МКОС). В данном аспекте актуальным является исследование адаптационных механизмов гомеостаза организма в условиях химической нагрузки, что позволит проводить донозологическую оценку сдвигов в оптимальном состоянии здоровья и разработать превентивные меры для его сохранения у больших контигентов населения [1]. Известно, что ключевым элементом адаптационных механизмов является способность клетки после воздействия агрессивных экзогенных факторов возвращаться в физиологическое состояние, что во многом зависит от структурной и функциональной полноценности цитоплазматической мембраны, которая является барьером для химических токсических веществ, попадающих во внутреннюю среду организма [2, 7].

Неинвазивным и информативным методом, позволяющим оценить состояние белково-липидного слоя клеточной мембраны после воздействия повреждающих факторов, является исследование структуры и функции биомембран путем регистрации фосфоресценции белков клеточной мембраны, которые являются специфическими рецепторами для связывания вирусов, антител и гаптенов [3]. В случае повреждения целостности цитоплазматической мембраны ксенобиотиком изменяется интенсивность фосфоресценции образцов биоматериала на разных длинах волн, а интенсификация свечения происходит в результате образования белковых молекул в триплетном нестойком состоянии. Так, например, триптофан и тирозин сыворотки крови испускают фотон энергии при снижении возбуждения при отсутствии света оптического диапазона, что позволяет отличить целостные мембраны от поврежденных по значительно более низким показателям фосфоресценции [2].

Цель работы: исследование состояния интегративных белков цитоплазматических мембран белых крыс, получавших субтоксические дозы МКОС в подостром эксперименте.

Методы и материалы. Эксперимент проводили на 95 крысах популяции Вистар, обоих полов, массой тела 180±10, которые в течение 45 суток получали внутрижелудочно 0,184 г/кг охлаждающей жидкости (ОЖ-40); 0,191 г/кг охлажающей жидкости (ОЖ-65); 0,116 г/кг тормозной жидкости Роса (ТЖ) и 0,117 г/кг гидравлической жидкости, что составило 1/100 LD₅₀ данных органических смесей. В контрольную группу входили интактные животные, получавшие по 2 мл водопроводной воды в сутки. Кровь для получения сыворотки у животных брали из хвостовой вены. Все исследования проводили с учетом этических требований к экспериментам на позвоночных животных [4]. Интенсивность перекисного окисления белков и степень их окислительной модификации оценивали путем регистрации фосфоресценции клеточных мембран и по показателям образования 2-4- динитрофенилальдогидразонов и динитрофенилкетогидразонов [5,6]. Оценивали фотолюминесценцию сыворотки крови крыс по интенсивности фосфоресценции, для чего облучали биологические образцы ультрафиолетом, а после прекращения возбуждающего действия регистрировали интенсивность фосфоресценции. Использовали люминометр, состоящий из фосфороскопа, позволяющего разделить во времени процессы облучения биоматериала возбуждающим светом и регистрацию показателей в условиях абсолютной защищенности от света фотоприемника [6]. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программы Statistica 4.5, результаты представляли в виде средних арифметических и их стандартных ошибок, достоверность различий между величинами определяли с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение. Результаты, получаемые при использовании метода фосфоресценции, хорошо подтверждаются аналогичными результатами электронного магнитно-резонансного метода и позволяют с высокой точностью оценить степень окислительной модификации белков. Известно, что белковые молекулы располагаются или на поверхности мембраны, или в ее гидрофобном слое, а особенностью мембранных белков является повышенное содержание гидрофобных аминокислотных окончаний, сравнительно с гидрофильными. Учитыва, что активные формы кислорода способны повреждать и липидные, и белковые структуры мембраны, можно предположить, что в результате их воздействия значительно нарушается структура и функция клетки, в частности, снижается ферментативная активность липидов [2, 7]. Кроме того, степень функциональной активности цитоплазматических мембран можно оценивать по соотношению анаболических и катаболических процессов в мембранных белках, их конформационным изменениям и нарушении их расположения в опрееленной последовательности. Следовательно, можно предположить, что увеличение содержания перекисей и гидроперекисей в сыворотке крови, возникающее в результате длительного действия субтоксических доз МКОС, стимулирует процессы окислительной модификации мембранных белков. Полученные в эксперименте данные свидетельствовали, что воздействие органических смесей приводило к значительному повышению интенсивности фосфоресценции сыворотки крови крыс (табл. 1).

Таблица 1

Показатели интенсивности фосфоресценции сыворотки крови крыс, получавших 1/100 LD₅₀ МКОС, (M±m), (имп/с).

Спектры возбуждения (λ)	Контроль	Многокомпонентные органические смеси
		ГдР	ГР	ОЖ-40	ОЖ-65
297	4248,6±68,7	4508,5±62,3*	4397,5±63,5*	4462,7±64,9*	4423,6±63,8*
313	3248,5±27,8	3858,9±40,7*	3579,9±31,6*	3704,6±33,2*	4228,2±36,7*
334	618,9±20,3	809,7±21,7*	786,8±19,7*	821,4±26,2*	846,3±26,4*
365	1889,5±39,4	2009,6±32,0*	2115,7±25,3*	2124,6±29,4*	2217,3±29,5*
404	459,7±17,9	627,5±17,8*	609,4±18,3*	658,3±23,7*	661,8±24,3*
434	609,6±14,8	827,5±21,3*	779,0±17,6*	836,8±16,3*	859,3±18,6*

Примечание: * - различия показателей статистически достоверны, (р<0,05).

Было зарегистрировано значительное повышение интенсивности свечения сыворотки крови крыс, которое остигало максимальных значений при действии коротких (λ = 297-334) и длинных волн (λ = 434). Полученные результаты позволяют предположить возникновение конформационных изменений молекул мембранных белков, что в результате приводит к потере структурной гибкости ферментов, снижению способности связываться с лигандом, нарушению структуры и функции клетки, развитию в ней деструктивных и дистрофических изменений [3]. Концентрацию 2,4-динитрофенилальдогидразонов и 2,4-инитрофенилкетогидразонов исследовали с целью уточнения степени активности катаболических процессов и стимуляции окислительной модификации мембранных белков (табл. 2).

Таблица 2

Инамика окислительной модификации белков цитоплазматической мембраны при действии 1/100 LD₅₀ МКОС, (M±m), (имп/с).

Органические смеси	Показатели, (сыворотка крови).
	2,4-динитрофенилальдогидразо ны (ед. опт.плотности/г белка, λ – 370 нм)	2,4-динитрофенилкетогидразо ны (ед. опт. плотности/г белка, λ – 380 нм)
Контроль	21,73±1,82	24,55±2,18
ГР	38,95±2,25*	43,76±1,54*
ГдР	39,41±2,17*	42,54±2,12*
ОЖ-40	39,82±2,19*	39,60±2,11*
ОЖ-65	39,94±2,21*	43,48±2,23*

Примечание: * - различия показателей статистически достоверны, (р<0,05).

Было установлено, что концентрация 2,4-динитрофенилальдогидразонов и 2,4-динитрофенилкетогидразонов повышалась во всех случаях, что подтверждало интенсификацию катаболических процессов и окислительной модификации белков клеточной мембраны крыс, получавших субтоксические дозы многокомпонентных органических смесей. Следовательно, длительное воздействие даже незначительных доз исследуемых веществ на организм может приводить к нарушению структуры и функции клеточной мембраны, изменениям внутриклеточного метаболизма, дисбалансу анаболических и катаболических процессов, что будет сопровождаться изменением функции мембранных интегративных белков [6, 8].

Таким образом, длительное поступление 1/100 LD₅₀ МКОС в организм крыс обусловливало повышение уровней 2,4-дифенилальдо- дифенилкетогидразонов, повышало интенсивность фосфоресценции сыворотки крови, особенно на коротко- и длинноволновом спектре волн возбуждения, что подтверждает интенсификацию окислительной модификации интегративных белков клеточной мембраны. Для дальнейшего изучения влияния субтоксических доз многокомпонентных органических смесей на основе гликолей на структуру и функцию клеточной мембраны, целесообразно также исследование полярности, текучести мембран, характера погружения белков в липидный слой мембраны, что позволит сделать донозологическое выявление ее повреждений своевременным. Неинвазивный метод фосфоресценции позволит обследовать большие группы населения, подвергающегося воздействию ксенобиотиков, и разработать профилактические меры предупреждения развития экологической патологии.

Література

1. Белозерова С.М. Особенности формирования заболеваемости в условиях индустриального труда и новых технологий / С. М. Белозерова // Медицина труда и промышленная экология. – 2011. - №3. – С. 13-19.

2. Зербино Д. Д. Экологическая патология и экологическая нозология: новое направление в медицине / Д. Д. Зербино // Мистецтво лікування. – 2009. - №8. – С. 37-41.

3. Дубинина Е. Е. Окислительная модификация протеинов, ее роль при патологических состояниях / Е. Е. Дубинина, А. В. Пустыгина // Український біохімічний журнал. – 2008. – Т. 80, №6. – С. 5-18.

4. Загальні етичні принципи експериментів на тваринах //Ендокринологія. – 2003. – Т.8. - №1. – С. 142-145.

5. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: методические рекомендации. Под ред.проф. В.Х.Хавинсона. – СПб: ИПК «Фолиант», 2000. – 104 с.

6. Пат. 52464А UA, МПК7G01N21/76. Пристрій для хемілюмінесцентних досліджень / Ф.А.Колодуб, В.М.Абашин; Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я.Данілевського АМН України. - №2002064693; Заяв.на 07.06.2002; Опубл. 16.12.2002, Бюл. №12. – С.3.

7. Chia N., Wang L., Lu X., Senut M. C., Brenner C., Ruden D. M. (2011). Hypothesis: Environmental regulation of 5-hydroxymethylcytosine by oxidative stress. Epigenetics 6, 853–856.

8. Mladenka P., Simůnek T., Hübl M., Hrdina R. (2006). The role of reactive oxygen and nitrogen species in cellular iron metabolism. Free Radic. Res. 40, 263–272.