Кандидат технічних наук Думенко В.П.
студентка
магістратури Цмуз Т.П.
Вінницький
державний педагогічний університет імені Михайла Коцюбинського, Україна
Дослідження зміни агрегаційних властивостей крові при
патологіях оптичними методами
Постановка проблеми. Вирішення проблем пов’язаних
з діагностикою та терапією захворювань серцево-судинної системи завжди
залишається актуальним завданням. Як свідчать результати досліджень, порушення
мікроциркуляції крові визначаються реологічними характеристиками крові, серед
яких важливу роль відіграє здатність до агрегації клітин крові. Сучасні
дослідження гемодинаміки включають удосконалення фізичної теорії процесів, математичного
моделювання та розробку неінвазивних методів для контролю реологічних
показників при виявленні патологій кровоносної системи.
Аналіз актуальних досліджень. На сьогодні даною проблематикою
займаються ряд науковців провідних науково-дослідних організацій України
(Вінницький національний технічний університет, Чернівецький національний
університет імені Ю.Федьковича, Харківський національний університет імені
В.Н.Каразіна), країн Європи, США, Росії. Серед відомих науковців варто
відзначити Тучина В.В., Павлова С.В.,
Хайруліну А.Я., Бєлоусова В.Б. Луговцова А.Є.,
Приезжева А.В.
Метою статті є обґрунтування фізичних механізмів та експериментальні дослідження процесів
агрегації еритроцитів для виявлення захворювань крові.
Виклад основного матеріалу. Однією із фундаментальних
властивостей еритроцитів є їх схильність до агрегації. Агрегація еритроцитів - динамічний і
оборотний процес їх взаємодії площами з найбільшими поверхнями, взаємодіючи один з одним, еритроцити
злипаються і утворюють так звані "монетні стовпчики ". Фізіологічна
агрегація в мікросудинах має характер лінійних ланцюжків у вигляді монетних стовпчиків
складаються з 5 - 10 клітин. (рис. 1)
Рис.1.
Агрегація еритроцитів
Ступінь агрегації визначається
здатністю еритроцитів зв’язуючись один з одним основами дисків утворювати
циліндричні ланцюжки. Число еритроцитів агрегатів може бути від декількох до
сотень їх, а довжина від 2 – 200 мкм.
Від агрегаційних властивостей еритроцитів
залежать гемодинамічні показники кровоточу, які визначаються насамперед
в’язкістю крові. В’язкість з фізичної
точки зору визначається формулою Ньютона:
, (1)
Формула (1)
справедлива для рідин коефіцієнт в’язкості яких є сталим параметром і не
залежить від умов руху рідини.
Кров не можна віднести до ньютонівських
рідин оскільки коефіцієнт в’язкості залежить не тільки від речовини, а
визначається умовами руху крові, а саме
зміною градієнта швидкості, яка є нелінійною.
, (2)
Де n – характеризує
механічні властивості при даних умовах руху рідини.
При цьому коефіцієнт
в’язкості крові буде визначатися формулою і концентрацією еритроцитів:
(3)
де К – геометричний
фактор, який залежить від форми і розмірів еритроцитів,
С – концентрація
еритроцитів.
Геометричний фактор К буде змінюватись
в залежності від руху крові в великих судинах і в капілярах і здатності
еритроцитів до агрегації. Тому при руху крові по дрібних капілярах важливим є
врахування ступеня агрегації та швидкості дезагрегації.
Відхилення від норми ступеня
агрегації еритроцитів характерні для різних захворювань системи крові. Так,
наприклад, при множинної мієломі (ММ), нерідко спостерігаються ускладнення, в
основі яких лежить порушення реологічних властивостей крові з розладом
мікроциркуляції, гіпервіскозний синдром, недостатність кровообігу та інше, що
суттєво погіршує стан хворих. Утворення агрегатів в кровотоці відбувається
безперервно і визначає роль еритроцитів у газообміні. При зворотній агрегації
еритроцитів відбувається віддача клітинам кисню і видалення продуктів розпаду.
Необоротна агрегація затримує виділення вуглекислоти з тканин, викликає
седиментацію і гіпоксію еритроцитів з подальшою дегенерацією, руйнуванням і
вивільненням еритроцитарних факторів згортання в кровотік, сприяючи порушення
мікроциркуляції в органах і тканинах.
Для визначення ступеня агрегації
використовують прямі і непрямі методи:
·
дифракційні;
·
спектрофотометричні;
·
осідання еритроцитів у капілярі;
·
на основі світлопропускання через
суспензію;
·
фотометричний;
·
силектрометрії тощо.
Дифракційні методи в цьому випадку є більш простими в технічному
рішенні. Оцінюючи
дифракційні картини різних зразків можна зробити висновок про ступінь агрегації еритроцитів.
Відомий спосіб визначення агрегації еритроцитів на основі
оцінки швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ). Спосіб полягає в порівнянні рівня
вільно осілих клітин, у вертикально встановленому капілярі з кров'ю протягом 2
годин і центрифугування протягом 20 хвилин при 3000 об/хв [1].
Метод оцінки агрегації еритроцитів на
основі дослідження мікроскопічної картини осідання еритроцитів у капілярі
повязаний з реєстрацією швидкості осідання клітин [2]. Однак круглий переріз капілярної трубки не дозволяє точно
сфокусувати зображення клітин або їх агрегатів. Крім того, на швидкість
осідання еритроцитів і в цьому випадку істотно впливає різна в'язкість середовища (плазми)
і концентрація еритроцитів (їх гематокрит). Отже, точність визначення агрегації
еритроцитів цим методом помітно обмежена. [6]
Спосіб вимірювання ступеня агрегації еритроцитів на
основі оцінки світлопропускання через пробу цільної крові або суспензії
еритроцитів в агрегуючому середовищі заснований на вимірюванні інтенсивності світлопропускання в залежності від агрегатного стану крові. Інтенсивна агрегація в зразку крові характеризується більш високою інтенсивністю проходження світла через зразок крові і навпаки.
Фотометричний метод є найбільш поширеним для дослідження
агрегаційних властивостей еритроцитів. З допомогою цього методу можлива
кількісна оцінка агрегатного стану крові - розмірів і щільності мікроагрегатів еритроцитів.
Метод «силектрометрії»
полягає в зменшенні світлорозсіювання після припинення перемішування в процесі
дезагрегації-агрегації клітин. У полі зору мікроскопа з вбудованим фоторезистором розташовується
предметне скло з наклеєним на відстані трьох діаметрів еритроцита покривним
склом. На покривному склі жорстко закріплений п'єзокристал, що живиться від
звукового генератора. У порожнину між скельцями вводиться проба цільної крові. У
міру збільшення напруги, звукового генератора зростає потужність коливання
верхнього скла, і агрегати починають руйнуватися. Відповідно змінюються екстинція і сигнал з фоторезистора. За допомогою
цього реєструється процес агрегації. [5]
Для дослідження впливу
захворювань крові на агрегаційні характеристики еритроцитів було проведено
експериментальні дослідження зразків капілярної крові здорових людей і з
діагнозом нормобластна анемія. Нормобластна
(залізодефіцитна) анемія — це захворювання крові коли продукуються нормальні
зрілі еритроцити, проте у недостатній кількості і з пониженим вмістом
гемоглобіну. [7]
Для визначення ступення агрегації
еритроцитів використовувався метод оптичної мікроскопії. Оптичні мікроскопи працюють за рахунок фокусування, дифракції і відбиття
електромагнітних хвиль видимого діапазону на препараті. Різновидами оптичної
мікроскопії є флуоресцентна, конфокальна, багатофотонна мікроскопія.
Біологічний
мікроскоп призначений для спостереження в світлі, що проходить, в світлому полі
зафарбованих і незафарбованих мазків
крові, клітинних концентратів,
тканинних біотипів, гістологічних зрізів в спеціальних камерах. При
застосуванні фазово-контрастних пристроїв, конденсорів
темного поля і
кутового освітлення можливе
спостереження малоконтрастних препаратів; оглядовий перегляд препаратів
крові і кісткового мозку; диференціювання клітин крові
за формою, структурою
ядра і цитоплазми;
виявлення нормальних і
патологічних еритроцитів;
виявлення антипових та малодиференційованих клітин;
підрахунок формених елементів крові; визначення лейкоцитарної
формули [4]. Найбільш поширеними в
медико-біологічній практиці являються
мікроскопи проходження
світла плоского поля.
За допомогою мікроскопів
можна досліджувати прозорі
і напівпрозорі об'єкти.
Традиційно
ці мікроскопи називають біологічними мікроскопами, незважаючи на те, що вони в
рівній мірі можуть з успіхом застосовуватися в інших областях науки і
техніки. В основу аналізу покладений
метод візуального аналізу аналогових мікроскопічних зображень та
математичної обробки двовимірних
розподілів інтенсивності дискретизованих за
допомогою мікроскопічних зображень
оптично-тонких гістологічних зрізів (мазків) біологічних
тканин (рідин). У результаті аналізу зображення будується гістограма,
тобто розподіл величини інтенсивності у досліджуваному масиві її значень.
В експериментальних
дослідженнях використовувались зразки крові у вигляді мазків.
Приготування і зафарбовування зразків
робили таким чином: чисте знежирене
предметне скельце прикладаємо до пальця щоб утворився мазок капілярної крові, швидко перевертаємо краплею
догори і розміщуємо на столі. Ліворуч від краплі прикладають ребром предметне
скло для того, щоб розмастити краплю під кутом 45°, чекають поки крапля вздовж
розтечеться і просохне. Після цього протилежно від краплі призводять смугу
ребром скла, мазок повинен бути напівпрозорим і закінчуватися нерівностями.
Тоді як мазок висихає, його фіксують фарбою Май-Грюнвальда протягом 3 хвилин,
щоб запобігти руйнуванню форменних елементів. Зафіксовані і сухі мазки фарбують
за Романовським.
Зображення отримані за
допомогою цифрової фотокамери зразків крові здорової людини та з діагнозом
нормобластна анемія представлені на рисунку 2.
a) b)
Рис.2. Зображення мазка крові під оптичним мікроскопом: a) з патологією; b)
здорової людини
Усереднені значення ступеня агрегації еритроцитів капілярної крові
представлені у таблиці 1 і таблиці 2.
Таблиця 1. Результати визначення ступеня
агрегації еритроцитів ( діагноз - нормобластна анемія)
|
№ п/п |
Кількість еритроцитів в ланцюжку |
Середнє Значення |
№ п/п |
Кількість еритроцитів в ланцюжку |
|
1 |
12 |
15 |
21 |
10 |
|
2 |
8 |
22 |
9 |
|
|
3 |
14 |
23 |
10 |
|
|
4 |
8 |
24 |
10 |
|
|
5 |
8 |
25 |
8 |
|
|
6 |
20 |
26 |
9 |
|
|
7 |
9 |
27 |
7 |
|
|
8 |
19 |
28 |
9 |
|
|
9 |
9 |
29 |
8 |
|
|
10 |
12 |
30 |
8 |
|
|
11 |
15 |
31 |
9 |
|
|
12 |
5 |
32 |
8 |
|
|
13 |
10 |
33 |
8 |
|
|
14 |
17 |
34 |
6 |
|
|
15 |
9 |
35 |
11 |
|
|
16 |
8 |
36 |
9 |
|
|
17 |
8 |
37 |
10 |
|
|
18 |
10 |
38 |
15 |
|
|
19 |
8 |
39 |
8 |
|
|
20 |
11 |
40 |
7 |
Таблиця 2. Результати визначення ступеня
агрегації еритроцитів (здорової людини)
|
№ п/п |
Кількість еритроцитів в ланцюжку |
Середнє значення |
№ п/п |
Кількість еритроцитів в ланцюжку |
|
1 |
5 |
6 |
21 |
8 |
|
2 |
5 |
22 |
5 |
|
|
3 |
7 |
23 |
6 |
|
|
4 |
5 |
24 |
9 |
|
|
5 |
8 |
25 |
10 |
|
|
6 |
4 |
26 |
5 |
|
|
7 |
6 |
27 |
5 |
|
|
8 |
9 |
28 |
5 |
|
|
9 |
6 |
29 |
5 |
|
|
10 |
5 |
30 |
4 |
|
|
11 |
6 |
31 |
7 |
|
|
12 |
4 |
32 |
5 |
|
|
13 |
10 |
33 |
5 |
|
|
14 |
4 |
34 |
4 |
|
|
15 |
6 |
35 |
6 |
|
|
16 |
7 |
36 |
6 |
|
|
17 |
5 |
37 |
4 |
|
|
18 |
6 |
38 |
5 |
|
|
19 |
4 |
39 |
5 |
|
|
20 |
5 |
40 |
6 |
Висновки. В роботі обґрунтовано вплив агрегаційних властивостей
еритроцитів на в’язкість крові при русі в дрібних судинах. Кров не можна
описувати формулою Ньютона для сили внутрішнього тертя, оскільки коефіцієнт
в’язкості залежить від параметрів циркуляції крові по великих судинах і дрібних
капілярах. В сучасній діагностиці застосовують фізичні методи дослідження
реологічних характеристик крові, особливо актуальними є оптичні методи:
фотометричні, дифракційні, спектрофотометричні, силектрометрії, тощо.
Проведено експериментальні
дослідження зразків капілярної крові здорових людей та з діагнозом нормобластна
анемія. Використана методика визначення ступеня агрегації за допомогою оптичної
мікроскопії пов’язана із визначенням середнього числа еритроцитів у агрегаті.
Середнє число еритроцитів в ланцюжку в нормі становить 5-10 еритроцитів. Було
виявлено, що при патологічних порушеннях середнє число в агрегаті - більше 10.
Агрегація еритроцитів впливає на в’язкість крові в системі мікроциркуляції і є
фізичною основою в залежності видимої в’язкості від швидкості кровотоку. Для
утворення агрегатів еритроцитів необхідна наявність в плазмі великих молекул
білків, які при певних порушеннях функціонування органів людини, а особливо
печінки виробляються у великій кількості. Тому визначення ступеня агрегації
еритроцитів дає можливість виявляти патологічні зміни в організмі людини.
Анотація. В роботі обґрунтовано фізичні механізми впливу агрегації
еритроцитів на в’язкість крові. Описано
фізичні методи дослідження ступеня агрегації еритроцитів. Представлено
результати експериментальних досліджень методом оптичної мікроскопії, ступеня
агрегації еритроцитів крові здорових людей та з діагнозом нормобластна анемія
та виявлено вплив на агрегаційні властивості клітин капілярної крові
патологічних змін в організмі.
Ключові слова. оптична мікроскопія, агрегація еритроцитів,
мікроциркуляція, реологічні властивості крові, в’язкість.
Список використаних
джерел:
1.
Dintenfass L., Elevation
of plasma viscosity and aggregation of red blood cells in melanoma metastasis
// Biorheoloigy. - 1978. - Vol.15. - 99-106.
2. Alexandrova L., Bessmeltsev S., Lendiaev A. et al. // Proc. SPIE. 2004.
V. 5447. P. 330–337.
3. Bessmeltsev S., Lendiaev A., Tarlykov V., Hodus I. // Proc. SPIE. 2002. V. 4680.
P. 177–180.
4. Аксенов Е.Т. Модифицированный лазерный
дифрактометр для исследования биологических микрообъектов / Е.Т. Аксенов, Д.В. Мокрова / Письма в ЖТФ, 2008, том 34, вып.
20. – С.38-43.
5.
Соколова И.А. Агрегация эритроцитов:
некоторые вопросы и гипотезы. / И.А. Соколова, С.Ю. Рыкова, А.А. Шахназаров
[и др.] // Российский журнал биомеханики. – 2011. – Т.15, №1 (51). – С. 7-22.
6.
Спасов А.А. Изучение агрегации
эритроцитов на лазерном агрегометре / А.А. Спасов, О.В Островский.,
А.Н. Дегтярев, А.Ф. Кучерявенко // Коагулология – 2008. – Т.73, № 7.
– С. 21-23.
7.
Степовая Е.А. Обратимая агрегация эритроцитов
у онкологических больных / Е.А. Степовая, Н.Ю. Часовских, В.В. Новицкий
[и др.]// Клин. лабор. диагностика. – 1998. –№ 6. – С. 21-22.