Биологические науки/6. Микробиология

К.б.н. Додонова А.Ш., Кабдеш И.М.

Карагандинский государственный университет им. академика Е.А. Букетова, Казахстан

Энтомопатогенные свойства Bacillus thuringiensis

Многие виды насекомых, как известно, являются вредителями растений, паразитами и переносчиками возбудителей болезней человека, полезных животных и растений. Изобретены самые разные способы и средства истребления насекомых и защиты от них человека, животных и растений. До последнего времени наиболее распространенным был химический метод борьбы с насекомыми. Но этот метод при высокой эффективности имеет три основных недостатка: во-первых, химические инсектициды в большинстве своем универсальны и убивают не только вредных, но и полезных насекомых (опылителей, энтомофагов); во-вторых, они загрязняют окружающую среду; в-третьих, за многолетнюю практику применения инсектицидов многие виды насекомых приобрели устойчивость к ним (примерно 260 видов вредителей сельского и лесного хозяйства и 170 видов паразитов человека и сельскохозяйственных животных). Все это вынудило пересмотреть практику использования химических инсектицидов и по-новому оценить химический метод контроля. Сейчас наиболее перспективным считается экологический подход, предусматривающий рациональное сочетание современных защитных приемов и биометода, в частности, использования энтомопатогенных бактерий как естественных паразитов насекомых. [1]

Энтомопатогенные бактерии, представляющие интерес для биологической защиты растений, относятся к трем семействам порядка эубактерий (Eubacteriales): Pseudomonadales, Enterobacteriales и Bacillales.

Bacillus thuringiensis (Bt) — наиболее распространенный вид энтомопатогенных бактерий. На основе разных подвидов создана серия биопрепаратов для защиты растений. В отличие от других видов рода Bacillus эта бактерия образует кристаллы. Впервые она была выделена Луи Пастером из гусениц тутового шелкопряда в конце XIX в., но идентифицирована германским ученым Берлинером из Тюрингии в 1911 г. Встречается повсеместно в почве, на поверхности листьев, в телах насекомых [2].

Bacillus thuringiensis - энтомопатогенный аэробный почвенный грамположительный микроорганизм, обладающий способностью в ходе споруляции образовывать кристаллоподобные включения, состоящие из энтомоцидных белков – эндотоксинов (также называемых Cry-белками) [5]. Хемоорганогетеротроф, факультативный анаэроб. Подвижны, образуют термоустойчивую спору, расположенную субтерминально. В центре клетки располагается кристалл токсина. Кристаллы имеют бипирамидальную, кубическую или округлую форму и расположены в спорангии на противоположном по отношению к споре конце клетки [3].

Предложено различать Bt по серовариантам, биовариантам, фаговариантам, патовариантам, т. е. по антигенным и биохимическим свойствам, чувствительности к фагам, и патогенности для насекомых соответственно. В настоящее время для идентификации Bt используют молекулярно-биологические методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для биозащиты важно разделение на патоварианты, из которых наибольшее значение имеют три: А, В и С. Патовариант А включает подвиды Bt, патогенные для отрядов Lepidoptera, В — для Diptera, С — для Coleoptera.

К метаболитам Bt относят ферменты, антибиотики и токсины [2]. Среди этих токсичных продуктов выделяют 4 компонента:

- α-экзотоксин, или фосфолипаза С, - продукт растущих клеток бактерий. Токсическое действие фермента связывают с индуцируемым им распадом незаменимых фосфолипидов в ткани насекомого, что приводит к гибели последнего.

- β-экзотоксин - накапливается в культуральной жидкости при росте клеток. Считают, что молекула β-токсина состоит из нуклеотида, связанного через рибозу и глюкозу с аллослизевой кислотой. Его действие, видимо, обусловлено ингибированием нуклеотидазы и ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связанных с АТФ, что приводит к прекращению синтеза РНК. По сравнению с другими токсинами действует медленнее, в основном при переходе от одного цикла развития к другому. По наблюдениям, β-экзотоксин - мутаген, поражающий генетический аппарат особей.

- γ-экзотоксин - малоизученный компонент, неидентифицированный фермент (или группа ферментов).

- δ-эндотоксин - параспоральный кристаллический эндотоксин. Образуется в процессе споруляции бактерии в противоположной от формирующейся споры части бактерии. На завершающей стадии спорообразования токсин приобретает форму 8-гранного кристалла. Кристаллы состоят из белка, аминокислотный состав которого близок для различных штаммов. Различие в восприимчивости некоторых видов насекомых к действию кристалла, по-видимому, связано с присутствием специальных кишечных протеаз, осуществляющих гидролиз кристаллов in vivo. Такими протеазами обладают не все насекомые, отсюда и избирательность действия δ-токсина. Чтобы насекомое погибло, кристаллы должны попасть в его организм. После поглощения кристаллов гусеницы перестают питаться. Первичным местом действия δ-токсина является средний отдел кишечника [4]. Белковые кристаллы эндотоксина образуются одновременно со спорами по одному, реже по два в каждой бактериальной клетке.

Основной вклад в развитие инфекционного процесса при заражении Bt вносит белковый кристаллический δ-эндотоксин. У разных подвидов бактерий кристаллы отличаются по форме и размерам. Так, у бактерий подвида kurstaki кристаллы бипирамидальной формы, israelensis — округлые, a tenebrionis — квадратные. Кристаллический эндотоксин слабоустойчив к действию температуры, нерастворим в воде и органических растворителях, однако легко растворяется до протоксина в слабощелочной среде [2].

В настоящее время описано более 60 подвидов Bt. Продуцируемые ими токсины различаются по специфичности энтомоцидного действия. Известны токсины, с высокой специфичностью убивающие отдельных представителей отрядов Lepidoptera (семейства Cry1 и Cry9), Coleoptera (семейство Cry3) и Diptera (семейства Cry4 и Cry11) на стадии личинки. Эндотоксины Cry2 обладают двойной специфичностью – для Lepidoptera и Diptera.

Большинство энтомоцидных белков имеют молекулярную массу 130-145 kDa (представители семейств Cry1, Cry4, Cry9 и др.). Попадая в кишечник насекомых, они подвергаются действию присутствующих там протеиназ, образуя устойчивые к дальнейшему протеолизу фрагменты 60-70 kDa - так называемые "истинные токсины". Для этих белков показана четко выраженная доменная структура. С-концевой район достаточно консервативен среди разных классов энтомоцидных белков. При протеолизе он легко деградирует путём отщепления небольших фрагментов с молекулярной массой 15-35 kDa, в свою очередь быстро подвергающихся дальнейшему гидролизу. N-концевой район (соответствующий "истинному токсину") относительно устойчив к протеолизу и гораздо более вариабелен у разных белков, нежели С-концевой район. Таким образом, исходные 130-145 kDa белки представляют собой протоксины, нуждающиеся в активации протеиназами кишечного сока насекомых.

Группа токсинов, к которой принадлежат представители семейств Cry2, Cry3, Cry10 и Cry11, включает в себя белки с молекулярной массой 60-70 kDa. По первичной структуре они напоминают N-концевые участки ("истинные токсины") 130-145 kDa белков [5].

Механизм действия эндотоксинов Bacillus thuringiensis.

При попадании в кишечник насекомого белковый кристалл растворяется в щелочной среде кишечного сока (рН 9.5-10.5); растворенные протоксины активируются протеолитическими трипсино- и химотрипсиноподобными ферментами кишечника до "истинных токсинов" (рис.1).

Рисунок 1. Механизм действия Cry-токсинов.

(a)- кристалл попадает в кишечник насекомого и растворяется; (b) - белок подвергается ферментативному гидролизу, образуется "истинный токсин"; (с) - II и III домены взаимодействуют с мембранным белком - рецептором; (d) - изменяется конформация I-го домена; (e) - несколько молекул токсина образуют в мембране пору или ионный канал.

Следующей стадией токсического воздействия является связывание "истинного токсина" с аффинным к нему белком (рецептором) на апикальной мембране эпителиальных клеток кишечника. Связывание токсина с рецептором является обратимым [5, 6, 7]. Далее происходит перестройка конформации молекулы токсина с последующим внедрением его в мембранный бислой. После этого связывание токсина с мембраной становится необратимым [5, 8]. Видимо, одновременно с внедрением в мембрану происходит ассоциация нескольких молекул токсина [5, 9]. Ансамбль трансмембранных участков ассоциированных молекул токсина образует пору или ионный канал. В первом случае (образование поры), происходит гибель клеток по механизму коллоидно-осмотического лизиса. Во втором (образование ионного канала) - вследствие резкого изменения ионного состава и рН внутриклеточной среды [5].

Другой гипотетический механизм образования поры в мембранах клеток - мишеней заключается в следующем. После взаимодействия петель второго домена с рецептором он меняет свою конформацию, затрагивая при этом пару спиралей первого домена, наиболее тесно взаимодействующих со вторым. В результате чего петли и шпильки, соединяющие α-спирали и расположенные ближе к мембране клетки-мишени входят в липидный бислой. Это, в свою очередь, вызывает некоторые повреждения мембраны, в результате которых его α-спирали пронзают мембрану и образуют пору [5].

Таким образом, из всего вышеописанного можно сделать вывод, что на данный момент существует множество подвидов Bt, отличающихся в той или иной степени вирулентности и эффективности против различных видов насекомых. Кроме того, на основе исследований зарубежных ученых следует, что большинство штаммов Bt содержит комбинации разных Cry-токсинов. Эти комбинации, как правило, проявляют синергический эффект. Синергизм может наблюдаться между кристаллами и спорами Bt. Хотя действие кристалла – ключевой момент в проявлении токсичности Bt, иногда необходимо присутствие и спор и кристаллов [2].

Литература:

1. Кандыбин Н.В. Бактериальные средства борьбы с грызунами и вредными насекомыми: теория и практика.  – М.: Агропромиздат, Москва: 1989. – 5 с.

2. Штерншис М.В. и др. Биологическая защита растений. – М.: КолосС, Москва: 2004. – С. 118-143

3. Bacillus thuringiensis [Электронный ресурс] – Режим доступа: https://ru.wikipedia.org. - Дата доступа: 25.11.2015

4. Промышленная биотехнология // Биотехнология в сельском хозяйстве // Энтомопатогенные препараты на основе бактерий [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://biotechnolog.ru. – Дата доступа: 25.11.2015

5. Статьи // Эндотоксины Bacillus thuringiensis [Электронный ресурс] – Режим доступа: http://rusbiotech.ru – Дата доступа: 25.11.2015

6. Hofmann C., P. Luthy, Binding and activity of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin to invertebrate cells, 1986, Arch. Microbiology, 146: 7-11.

7. Hofmann C., P. Luthy, R. Hutter, V. Pliska, Binding of the delta-endotoxin from Bacillus thuringiensis to brush-border membrane membrane vesicles of the cabbage butterfly (Pieris brassicae), 1988, European Journal of Biochemistry, 173: 85-91.

8. Ihara H., E. Kuroda, A. Wadano, M. Himeno, Specific toxicity of d-endotoxins from Bacillus thuringiensis to Bombyx mori, 1993, Bioscience, Biotechnology, Biochemistry, 57: 200-204.

9. Masson L, Tabashnik BE, Liu YB, Brousseau R, Schwartz JL., Helix 4 of the Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin lines the lumen of the ion channel, Journal of Biological Chemistry 1999 Nov 5;274(45):31996-2000.