ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ОБРАЗОВАНИЯ ЭТАНОЛА И КСИЛИТА КСИЛОЗОАССИМИЛИРУЮЩИМИ ДРОЖЖАМИ

 

SOME metabolic FEATURES of ethanol AND XYLITOL production by xylose assimilation yeastS

 

Ольга Ивановна Болотникова, Наталья Павловна Михайлова,
Анатолий Иосифович Гинак

 

Изучена активность ферментов катаболизма D-ксилозы у гаплоидных мутантов дрожжей Pachysolen tannophilus, селективно продуцирующих ксилит, либо этанол. Ксилит-образующий штамм имел низкие активности НАДФ×Н-ксилозоредуктазы, НАД+-зависимой малатдегидрогеназы и цитохром с оксидазы (4,40; 4,80; 1,87 и 0,28 МкМоль/мг×мин, соответственно). У спиртообразующих мутантов были достаточно высокие активности НАД×Н/НАДФ×Н-ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы (6,0-6,80 и 6,80-8,40 МкМоль/мг×мин), а также 1-глицерофосфатдегидрогеназы (4,68 МкМоль/мг×мин) и лактатдегидрогеназы (16,48 мкмоль/мг×мин). Обсуждается регенерация НАД×Н2 в условиях аэрации, благоприятствующих спиртообразованию из D-ксилозы.

 

Ключевые слова: D-ксилоза, ксилит, этанол, мутанты дрожжей P. tannophilus.

 

D-xylose catabolic enzymes activity in haploid mutants of the yeast P. tannophilus, producing xylitol or ethanol was investigated. The xylitol-accumulating mutant had low levels of НАДФ×Н-xylose reductase, xylitol dehydrogenase, NAD+-dependent malate dehydrogenase and cytochrome c oxidase (4,40; 4,80; 1,87 and 0,28 mMol/mg×min-1,  respectively). The ethanol-producing mutants demonstrated high activities of NAD×H/NADP×H-xylose reductase and xylitol dehydrogenase (6,0-6,80 and 6,80-8,40 mMol/mg×min-1) as well as 1-glycerophosphate dehydrogenase (4,68 mMol/mg×min-1) and lactate dehydrogenase (16,48 mMol/mg×min-1). The regeneration of NAD×H2 in semi aerobic conditions, favoring the ethanol formation from D-xylose is discussed.

 

Keywords: D-xylose, xylitol, ethanol, mutants of the yeast P. tannophilus.

 

Динамичное развитие мировой цивилизации невозможно без поиска энергоносителей, альтернативных нефти и каменному углю. По сравнению с другими формами биоэнергии этиловый спирт выгодно отличают низкие стоимость и токсичность для окружающей среды [7]. Главным условием его конкурентоспособности на рынке моторного топлива считают использование в качестве сырья отходов сельского хозяйства, лесного и лесоперерабатывающего комплекса, а также сульфитных щелоков - побочных продуктов целлюлозно-бумажного производства. Их спиртовую конверсию обеспечивают дрожжи, ассимилирующие D-ксилозу, на долю которой приходится от 20 до 92% сахаров вторичных непищевых источников растительной биомассы [10]. Однако накопление ксилита в ходе микроаэробной ферментации D-ксилозы снижает биотехнологическую ценность таких объектов. Конструирование утилизирующих D-ксилозу штаммов Saccharomyces cerevisiae существенно затрудняет недостаточная изученность метаболической регуляции образования ксилита и этанола [14]. Удобным инструментом для ее анализа могут служить гаплоидные мутанты ксилозоассимилирующих дрожжей P. tannophilus 22-Y-1532/B2 №390 (фенотип Glu+Xyl+XylOH±EtOH-), №442 (фенотип Glu+Xyl+XylOH-EtOH+) и №664 (фенотип Glu+Xyl±XylOH±EtOH±) селективно продуцирующие этанол или ксилит [2].

Известно, что у дрожжей превращение D-ксилозы в
D-ксилулозу осуществляют ферменты ксилозоредуктаза (XR) и ксилитдегидрогеназа (XD). Распространена гипотеза, объясняющая накопление ксилита формированием дисбаланса НАДФ/НАД×Н2 вследствие неодинаковой специфичности XR и XD при дефиците кислорода в среде [8]. Поэтому оценили не только общую, суммарную активность этих ферментов, но также их специфическую активность в присутствии различных пиридинзависимых динуклеотидов при микроаэробном режиме, благоприятствующем образованию этанола из D-ксилозы [1]. Эксперимент проводили согласно рекомендациям [4], в качестве положительного контроля использовали характеристики родительского гаплоидного штамма P. tannophilus 22-Y-1532/В2. Наименьшие активности обоих исследуемых ферментов выявили у мутанта №664, селективно накапливавшего ксилит. XR этого штамма имела преимущественное сродство к НАДФ×Н2, тогда как 95,0% активности XD было ассоциировано с коферментом НАД+. Значительно большая активность ферментов начальных этапов катаболизма D-ксилозы отличала спиртообразующие мутанты №390 и 442. Их XR имела ярко выраженную двойную НАД×Н/НАДФ×H -специфичность и XD с высоким сродством к коферменту НАД+ (Таблица).

Трансформация D-ксилулозо-5-фосфата в фруктозо-6-фосфат и глицеральдегид-3-фосфат осуществляется посредством реакции неокислительного этапа пентозофосфатного цикла. Их дальнейший метаболизм зависит от степени аэрации ферментационной среды. Однако даже при недостатке кислорода доля пирувата, используемая ксилозоассимилирующими штаммами для реакций спиртообразования ниже поступающей в ЦТК [11]. Вероятно, точки, лимитирующие выход спирта из D-ксилозы, затрагивают различные этапы общих путей катаболизма сахаров. Поэтому изучили особенности функционирования 1-глицерофосфатдегидрогеназы (1-ГДФ), НАД+-зависимой малатдегидрогеназы (МДГ), цитохром с оксидазы (ЦО) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) мутантов P. tannophilus в условиях, благоприятствующих спиртообразованию [1]. Общие активности этих ферментов определяли в бесклеточных экстрактах дрожжей широко известными методами [5,6].

Минимальные активности 1-ГДФ, МДГ и ЦО косвенно доказали, фактически, полное блокирование транспорта электронов и протонов на дыхательную цепь митохондрий у штамма, накапливавшего ксилит. Спиртообразующие мутанты продемонстрировали существенные различия. Так, общие активности 1-ГДФ, МДГ и ЦО штамма №390 оказались на 54%, 57% и 40% ниже контрольных результатов, соответственно, хотя аналогичная величина ЛДГ значительно возросла. У мутанта №442 общие активности 1-ГДФ, ЦО и ЛДГ мало изменились, а общая активность МДГ была угнетена (Таблица).

Таким образом, продукцию ксилита и этанола необходимо рассматривать как скоординированную перестройку углеводного обмена дрожжевой клетки в целом, а не только как результат изменения активности начальных стадий катаболизма D-ксилозы. Его блокирование на уровне ксилита - следствие развития дисбаланса НАДФ/НАД×Н2 при условиях микроаэробиоза из-за различной коферментной специфичности ксилозоредуктазы и ксилитдегидрогеназы. Однако увеличению концентрации НАД×Н2 также способствовало ингибирование целого ряда НАД×Н2/НАД+-зависимых дегидрогеназ общих путей катаболизма, локализованных не только в цитозоле, но и митохондриях. Поэтому избыточное накопление ксилита может демонстрировать своеобразное проявление "эффекта Пастера" применительно к D-ксилозе, запасному источнику углерода дрожжевой клетки.

Селективное образование этанола из D-ксилозы невозможно без гибкого регулирования баланса НАДФ/НАД×Н2 при дефиците кислорода в среде. Помимо дыхательной цепи у ксилозоассимилирующих дрожжей, факультативных анаэробов [9], функционирует, как минимум, три-четыре дополнительных точки регенерации НАД×Н2. Одной из них является реакция восстановления D-ксилозы в ксилит, хотя степень ее влияния на баланс НАДФ/НАД×Н2 зависит от активности и специфичности ксилозоредуктазы. Роль альтернативных кислороду акцепторов электронов и протонов могут выполнять интермедиаты пентозофосфатного цикла, пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса и цикла Кребса, подобные диоксиацетонфосфату, пирувату и оксалоацетату. Хорошо выраженный ингибирующий эффект спирта на штаммы


Таблица. –Удельная активность некоторых дегидрогеназ, участвующих в катаболизме D-ксилозы у мутантов
P. tannophilus, селективно продуцирующих ксилит или этиловый спирт.

ОСНОВ-НОЙ ПРОДУКТ

№ мутанта

АКТИВНОСТЬ, мкМоль/мгмин

XR

XD

1-ГФД

МДГ

ЦО

ЛДГ

НАД×Н

НАДФ×Н

НАД+

НАДФ+

КСИЛИТ

664

1,40

3,00

4,55

0,25

1,10±0,11

1,87±0,08

0,28±0,08

5,34±0,10

ЭТАНОЛ

390

3,20

2,80

8,00

0,40

2,61±0,09

3,04±0,09

0,56±0,09

16,48±0,11

442

3,60

6,45

0,35

4,68±0,10

4,26±0,09

1,29±0,09

7,14±0,07

К

5,40

5,00

7,70

0,30

4,86±0,09

5,37±0,10

1,39±0,04

7,72±0,10

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Примечания:

XR - ксилозоредуктаза (ЕС 1.1.1.21);

XD - ксилитдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.9);

1-ГФД - 1-глицерофосфатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.8);

МДГ- НАД+-зависимая малатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.37);

ЦО- цитохром с оксидаза (ЕС 1.9.3.1);

ЛДГ- лактатдегидрогеназа (ЕС 1.1.1.27).

К - исходный штамм P. tannophilus 22-Y-1532/В2, его характеристики выделены темным цветом.

Жирным шрифтом выделены наибольшие, а курсивом - наименьшие значения общей активности исследуемых ферментов.

ксилозоассимилирующих дрожжей [12] делает возможным предположение об их участии в генерации дополнительного количества НАДФ×Н2 и АТФ, необходимых для синтеза различных биополимеров, в том числе фосфолипидов биомембран [13]. Тогда доминирование процессов роста и размножения над спиртообразующей активностью дрожжей P. tannophilus носит генетически-детерминированный характер. Поэтому разобщение роста дрожжевой культуры традиционный прием сбраживания гексоз [3] не может принципиально улучшить спиртообразование из D-ксилозы. Решить такую задачу помогут дополнительные факторы, блокирующие переключение интермедиатов гликолиза на другие пути обмена дрожжевой клетки.

 

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.   Болотникова О.И., Михайлова Н.П., Гинак А.И., Немова Н.Н.// Ученые записки Петрозаводского государственного университета, Серия: естественные и технические науки. 2010. № 6(III). С. 14.

2.   Болотникова О.И., Трушникова Е.П., Михайлова Н.П., Гинак А.И.// Микробиология. – 2015. – Т.84, №4. – С. 411.

3.   Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. М: Издательство: Изд-во МГУ, 1995. 224 стр.

4.   Зверлов В.В., Юрьев М.З., Могутов И.А. // Биотехнология. 1990.  №5. С. 20.

5.   Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. Серия учебная лит-ра. М: Изд-во Высшая школа, Издание 2-е переработ. и дополн., 1980. 272 с.

6.   Чупахин Г.Н. Физиологические и биохимические методы анализа растений: Практикум. Калининград: Изд-во Калинингр. гос. ун-та, 2000. – 59 с.

7.   Lim S.H., Darah I., Che O. // Bioresources. 2013. V. 8, №1. Р. 969.

8.   Ko B.S., Kim J., Kim J.H. // Appl. Environ. Microbiol. 2006 V.72, №6. P. 420.

9.   Kreger Van Rij N.J.W. The yeasts, a taxonomic study. 3rd ed. Amsterdam: Elsevier Science Publ. Co, 1984. – 1082 p.

10.   Novy V., Krahulec S., Longus K., Klimacek M., Nidetzky B. // Bioresource Technol. 2013. V. 130. P. 439.

11.   Schneider H. // Crit. Rev. Biotech. 1989. №9. P. 1-40.

12.   Skoog K., Hahn-Hagerdal B., Degn H., Jacobsen J.P., Jacobsen H.S. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58, I.8. P. 2552.

13.   Suga H., Matsuda F., Hasunuma T., Ishii J., Kondo A. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012. V. 97, I.4. P. 1669.

14.   Tantirungkij M., Nakashima N., Seki T., Yoshida T. // J. Ferment. Bioeng. 1993. V. 75, I.2. P. 83.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1) Болотникова Ольга Ивановна, к.б.н., доцент каф. молекулярной биологии, биологической и органической химии Петрозаводского государственного университета, 185910, Петрозаводск, пр. Ленина 33; тел. раб. (814 2) 784697;

e-mail: bolot@onego.ru

3) Михайлова Наталья Павловна, д.б.н., ст. науч. сотр. каф. молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета), 190013, Санкт-Петербург, пр. Московский 26; тел. раб. (812) 494-92-67;

e-mail: m_natalia2@rambler.ru.

3) Гинак Анатолий Иосифович, д.х.н., проф., каф. молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета), 190013, Санкт-Петербург, пр. Московский 26; тел. раб. (812) 494-92-67;

e-mail: mbti@lti-gti.ru.