Биологические науки/6

Биологические науки/6. Микробиология

к.м.н. Гордина Е.М.¹, д.м.н. Горовиц Э.С.², к.м.н. Поспелова С.В.²

¹Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет, Россия

²Пермская государственная медицинская академия

им. ак. Е.А. Вагнера, Россия

Сравнительная оценка биопленкообразования штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от практически здоровых детей и инфицированных

Mycobacterium tuberculosis

Бактерии рода Staphylococcus как представители нормобиоты входят в состав микробиоценноза человека. Особенно часто они колонизируют различные участки кожи, слизистые оболочки носа и зева. Стафилококки могут существовать и в виде сложноорганизованных сообществ – биопленок [5], которые являются ключевой фазой бактериального развития, обусловливающего выживание бактерий [1,3,4]. Под биопленками принято понимать постоянно обновляющееся сообщество микроорганизмов, закрепившихся на биогенном или абиогенном субстрате, и окруженных полимерным матриксом, который предохраняет их от вредных воздействий и является одним из факторов межклеточного взаимодействия [1,2].

Биопленкообразование это сложный комплексный процесс, сформировавшийся в процессе эволюции, как способ выживания в различных условиях обитания. Стафилококки обладают разнообразным набором факторов для его реализации. Это позволяет им «комфортно» существовать в различных условиях, быть защищенными от вредных факторов окружающей среды и, самое главное, противостоять действию различных антибактериальных препаратов [2,3].

Известно, что на процесс биопленкообразования могут оказывать влияние различные факторы, в том числе и постоянное применение антибактериальных препаратов [2,3].

Цель исследования – сравнительные анализ степени выраженности биопленкообразования штаммов Staphylococcus aureus, изолированных от практически здоровых детей и инфицированных микобактериями туберкулеза.

Материалы и методы. Выполнено бактериологическое исследование 28 мазков со слизистых носа и зева детей, инфицированных микобактериями туберкулеза, которые находились на лечении в Краевом детском санатории «Малыш» (г. Пермь). Первые пробы (14) забирали при поступлении, вторые – через месяц на фоне противотуберкулезной терапии. Обследованы также на стафилококковое бактерионосительство 36 практически здоровых детей, посещающих детские дошкольные учреждения г. Пермь. Обе группы сопоставимы по полу и возрасту.

Выделение культур стафилококков осуществляли традиционным методом с использованием желточно-солевого агара в соответствии с Приказом МЗ СССР № 535 «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений», идентифицировали на основании изучения биохимических свойств, используя тест-системы «Staphytest 24» фирмы «ERBА LACHEMA» (Чехия). Оценку результатов осуществляли с помощью компьютерной программы «Микроб-2».

Биопленкообразующую способность S. aureus изучали в 96-луночных полистироловых планшетах для иммуноферментного анализа. В 6 лунок каждого ряда планшета вносили по 100 мкл инокулума определенного штамма, содержащего 10⁷КОЕ/мл, после чего планшеты инкубировали в течение 24 часов (37⁰С). Через сутки планктонную культуру удаляли и биопленки дважды промывали 10 мМ фосфатным буфером (рН 7,2), затем окрашивали 0,1% раствором генцианвиолета с последующей спиртовой экстракцией связавшегося красителя. Детекцию окрашенных экстрактов биопленок осуществляли на ридере BenchmarkPlus при длине волны 570 нм. Степень выраженности биопленкообразования (БПО) стафилококков определяли в соответствии с критериями, разработанными S. Stepanovic [5].

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программы Statistica 6.0. О статистически значимых различиях полученных результатов в сравниваемых группах судили по величине цифровых значений р. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

Результаты. От детей, инфицированных M. tuberculosis, выделено 33 штамма стафилококков, в том числе 14 изолятов при первичном обследовании (S. aureus – 3, коагулазоотрицательных (КОС) – 11) и 19 – при повторном (S. aureus – 7, КОС – 12). Таким образом, на фоне специфической антибактериальной терапии инфицированность S. aureus биотопов детей статистически значимо выросла – до терапии составила 21,4±5,7%, после – 36,8±9,8% (р=0,009).

Со слизистой оболочки практически здоровых детей изолированно 28 культур стафилококков, из них 12 штаммов S. aureus. Инфицированность S. aureus биотопов составила 33,3±8,8%.

Все культуры S. aureus не зависимо от источника выделения характеризовались способностью образовывать биопленки. При этом более половины штаммов, выделенных от инфицированных детей, при первичном обследовании характеризовались низкой степенью выраженности БПО (66,7±22,2%), средней – 33,3±11,1%. На фоне специфической антибактериальной терапии число штаммов S. aureus с низкой степенью БПО увеличилось и составило 83,3±27,8%, средней – 16,7±5,6%, однако эти различия не были статистически значимы (р>0,05).

Следовательно кратковременная антибактериальная терапия по существу не влияла на интенсивность БПО S. aureus.

В последующем проведен сравнительный анализ степени выраженности БПО S. aureus, выделенных от детей, инфицированных микобактериями туберкулеза и практически здоровых. 77,8±25,9% культур S. aureus, изолированных от детей, инфицированных микобактериями туберкулеза, обладали низкой степенью выраженности БПО, 22,2±7,4% – средней. Что касается штаммов, выделенных от здоровых детей, то число S.aureus с низкой и средней степенью БПО составило по 50,0±14,4%. Полученные различия статистически значимы (p=0,042).

Штаммов с высокой степенью выраженности БПО в том и другом случаях выделено не было.

Таким образом, со слизистой оболочки носоглотки здоровых детей и инфицированных микобактериями туберкулеза, практически с одинаковой частотой изолировали S. aureus. Все выделенные культуры обладали способностью к образованию биопленок. Установлено, что кратковременная противотуберкулезная терапия, по существу, не оказывает влияние на интенсивность биопленкообразования S. aureus. Изоляты S. aureus практически здоровых детей статистически значимо чаще обладали средней степенью выраженности данного признака, в сравнении с культурами, выделенными от инфицированных микобактериями туберкулеза детей, для которых была характерная низкая степень БПО.

Список литературы:

1. Маянский, А. Н. Стафилококковые биопленки: структура, регуляция, отторжение / Маянский, А. Н., Чеботарь И. В. // Журн. микробиол. – 2011. – № 1. – С. 101-108.

2. Чеботарь, И. В. Механизмы антибиопленочного иммунитета / И. В. Чеботарь // Вестник РАМН. – 2012. – № 12. – С.22-29.

3. Biofilm forming multi drug resistant Staphylococcus spp. among patients with conjunctivitis / Murugan K., Usha M., Malathi P., Al-Sohaibani A.S., Chandrasekaran M. // Pol J Microbiol. – 2010. – Vol. 59, No. 4. – P. 233-239.

4. Prevention and treatment of Staphylococcus biofilms / P. Speziale, L. Visai, S. Rindi et al. // Curr. Med. Chem. – 2008. – Vol. 15, No. 30. – Р. 3185- 3195.

5. Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci / Stepanovic S., Vukovic D., Hola V., Di Bonaventura G., Djukic S., Cirkovic I. // APMIS. – 2007. – Vol. 115, No. 8. – P. 891-899.