Оценка безопасности и токсичности наночастиц металлов, как прототипов ветеринарного нанонутрицэвтика, по определению системных биомаркеров в экспериментах in vitro и in vivo

А.Т. Куцан, док. вет. наук, проф., чл.-корр. НААН,

М.Е. Романько, канд. биол. наук,

А.Л. Оробченко, канд. вет. наук

Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины», г. Харьков, Украина

Уникальность наноматериалов связана с их высокой химической и биологической активностью, способностью проникать через биологические барьеры – влиянием на метаболические процессы и структуру ДНК в клетках и тканях живых организмов. В таком контексте наночастицы металлов, как одну из наиболее биосовместимых форм, можно рассматривать как субстанции для ветеринарных препаратов и использовать в кормлении животных, лечении, диагностике и профилактике заболеваний различной этиологии. Особенного внимания заслуживают наночастицы эссенциальных металлов в составе кормовых добавок в рационах животных и птицы – нанонутрицэвтиков.

В настоящее время вопрос о безопасности и токсичности различных наночастиц остается открытым. Кроме этого при практическом их использовании в гуманной и ветеринарной медицине приобретает особую актуальность проблема биосовместимости и биодоступности новых наноматериалов на моделях биологических систем разного уровня организации. Оценка потенциальных рисков использования наноматериалов может быть адекватным при исследовании биомаркеров – ключевых системных характеристик живого организма (физиологических, биохимических, иммунологических, генетических и т.д.).

Целью этой работы была оценка уровня биобезопасности, биосовместимости и биодоступности наночастиц металлов и их композиционной смеси в экспериментах in vitro и in vivo в условиях воспроизведения острой токсичности.

В работе использовали синтезированные конденсационным методом наночастицы металлов (НчМе) в виде коллоидных дисперсий: наночастицы арґентума (Ag), ферума (Fe), купрума (Cu), цинка (Zn), двуокиса мангана (Mn), гексацианоферрата кобальту и кобальту (Co) с исходною концентрациею 1270,0, 3174,0, 2678,6, 2407,0, 2785,0, 2489,0 і 1991,6 мкг/мл соответственно. Средний размер НчМе составлял от ~31,5 нм до ~100,0 нм. Наночасицы металлов имели сферическую геометрию.

При изучении генотоксичности НчМе на модели культуры клеток СНО-К1 установлено, что наночастицы гексацианоферрата Co, Co і Zn в концентрациях (0,16-830,0), (0,12-664,0) и (0,25-802,0) мкг/мл вызывали нарушения структуры ДНК клеток. Значения І_ДНК находились в пределах таких для клеток, обработанных тестовым мутагеном, и указывает на проявление генотоксического действия этих наночастиц. Образцы наночастиц Ag, Fe, Cu и Mn в указанных концентрациях выявились безопасными по отсутствию генотоксических эффектов (значения І_ДНК были достоверно близкими к таким для интактных клеток (контроль)).

Полученные данные кореллировали с результатами определения мутагенных свойств наночастиц. На модели апикальной меристемы Allium cepa установлено, что наночастицы Co и Zn значительно угнетали активность митотических процессов: уровень митотического индекса снижался в 2,9 и 4,6 раз, а количество аберантных клеток превышало в 5 и 10 раз контрольный уровень, что дает основание утверждать про выраженные мутагенные свойства наночастиц этих металлов и определяет ответственный подход при их использовании.

В результате биохимических исследований установлено безопасность наночастиц Ag и Fe в остаточной концентрации 1 мкг/мл: вследствие преинкубации с субклеточными фракциями СНО-К1 регистрировали отсутствие угнетения активностей мембранной АТР-зы и усиления цитозольной ЛДГ-зы относительно их значений для интактных клеток (р≤0,05). Анализируя результаты изучения безопасности НчМе с использованием генотоксических, мутагенных и биохимических маркеров в условиях in vitro, было составлено композиционную смесь наночастиц Ag, Cu, Fe і Mn (НкМе).

В условиях проведения острого эксперимента на белых крысах-самцах (n=144) линии Вистар было изучено биосовместимость и биодоступность НкМе после однократного введения per os, в диапазоне доз: биотических – 3 мл/кг НкМе и смеси Ме; токсических – 10, 20 і 40 мл/кг массы тела.

При патологоанатомическом вскрытии крыс на 1-, 3-, 7- и 14-е сутки регистрировали вздутие желудка и толстого отдела кишечника вследствие влияния НкМе во всем дозовом диапазоне. Превышение коэффициэнтов массы внутренних органов (р≤0,05) свидетельствует о том, что основными «мишенями» биологического влияния НкМе являются селезенка и легкие; с увеличением дозы композита под комплексное влияние наночастиц вовлекаются почки, печень и сердце.

Полученные данные коррелируют с динамикой показателей кроветворной системы у животных, которым вводили НкМе в дозах 10, 20 і 40 мл/кг. В крови крыс на всех сроках исследования регистрировали лейкоцитоз (в среднем до 23,7 %), угнетение эритропоэза (в среднем до 38,2 %) с снижением содержания общего Hb (в среднем до 17,6 %); увеличение уровня серомукоидов (в среднем на 32,3 %) относительно контроля (р≤0,05). Уровень ЦИК средней молекулярной массы увеличивался в среднем на 58 % у всех животных, которым вводили металлы как в ионной, так и в наноразмерной форме. Более выраженные изменения показателей были зафиксированы для крыс после введения НкМе в дозах 10 и 40 мл/кг, что указывает на дозозависимую тропность наночастиц относительно состояния гемопоэза и природной резистентности организма животных.

Значительные изменения в функциональном состоянии печени крыс наблюдали с 1-х суток опыта: на фоне активации мочевинообразования и торможения гликолиза регистрировали напряжение активности ферментных систем природной детоксикации, что сопровождалось угнетением активности АлАТ и гиперферментемией АсАТ, ГГТ и ЛФ (р≤0,05). Изменения показателей были более выраженными при введении НкМе в дозе 10 мл/кг, на протяжении 14 суток, что указывает на выборочную токсичность последнего и следовательно на несбалансированность процессов детоксикації в организме животных.

О нарушении функционально-структурного состояния мембран клеток вследствие введения крысам биотической дозы смеси Ме и увеличенных доз НкМе указывает чрезмерное образование производных ОМБ на протяжении всего эксперимента, а, начиная с 3-х суток, – снижение уровня продуктов ПОЛ относительно контроля (р≤0,05). При этом, выявилось недостаточным потенциала природной АОС для нормализации интенсивности окислительных процессов, что выражалось в активации каталазы и расходовании пула эндогенных антиоксидантов (р≤0,05) в крови крыс.

В динамике эксперимента исследовали также накопление и распределение Cu, Fe і Mn в организме опытных крыс.

Т. обр., исследованиями в условиях in vitro, установлено, что с использованием генетических и биохимических маркеров, можно адекватно оценивать биобезопасность НчМе, а полученные результаты могут быть прогностическими при их использовании в ветеринарной медицине и биотехнологии. В остром эксперименте на модели in vivo установлено, что НкМе в дозовом диапазоне имеет высокую биодоступность. Однако, полученные данные недостаточно отображают токсические эффекты биологического влияния НчМе: некоторые клинико-биохимические показатели крови крыс возвращались к их физиологическим уровням как при введении биотических доз металлов, так и максимальной дозы НкМе. Поэтому целесообразно последующие исследования направить на изучение эффектов хронического поступления композиций НчМе в организм лабораторных животных; данные об их биосовместимости и биодоступности будут базовыми для доклинического и клинического тестирования наноматериалов как субстанций ветеринарных препаратов и кормовых добавок.