Протективная роль наночастиц металлов в физиолого-биохимических механизмах репарационных процессов лиофилизированных/регидратированных клеток Salmonella

М.Е. Романько, канд. биол. наук

Национальный научный центр «Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины», г. Харьков, Украина

Л.С. Резниченко, канд. биол. наук

В.А. Ушкалов, док. вет. наук, проф., чл.-корр. НААН,

М.В. Рубленко, док. вет. наук, проф., академик НААН

Государственный научно-контрольный институт биотехнологии и штаммов микроорганизмов, г. Киев, Украина

Качественно новый уровень борьбы с инфекционными заболеваниями может быть обеспечен за счет использования современных нанобиотехнологий. Выраженная биологическая и химическая активность наноматериалов определяет характер их влияния, свойства кинетики на клеточном и на уровне макроорганизма вцелом. Например, наночастицам аурума, покрытым попеременно субнанометровыми анионными и гидрофобными группами, свойственна мембранотропность, без нарушения структуры цитоплазматической мембраны, резистентность к абсорбции белками плазмы и могут использоваться в качестве компонентов иммунобиологических препаратов (пробиотиков, вакцин, питательных сред), как стимуляторы биологических свойств промышленно значимых штаммов, как векторы целевой терапии и т.д. Так, установлены эффективные размерные и концентрационные диапазоны наночастиц металлов (НчМе), обуславливающие стимуляцию показателей жизнеспособности микробной клетки и/или значительное угнетение функциональной активности с вираженным бактерицидным эффектом.

Целью работы было изучение влияния предварительного культивирования наночастиц аурума (Au) и аргентума (Ag) в диапазоне концентраций на интенсивность физиолого-биохимических реакций лиофилизированных/регидратированных клеток Salmonella производственных штаммов.

В работе использовали синтезированные конденсационным методом препараты наночастиц аурума (Нч Au) и арґентума (Нч Ag) в виде коллоидных дисперсий, с исходной концентрацией 38,6 мкг/мл и 86,4 мкг/мл по металлу. Средний размер НчМе, имеющих сферическую геометрию, составлял ~30 нм.

Методом трансмиссионной электронной микроскопии было проведено визуализацию контактного взаимодействия Нч Au и Ag с культурами клеток производственных штаммов S. Dublin 12, S. Typhimurium 16, S. Enteritidis 34 и М. Предварительно биомассу суточных культур клеток, ресуспендированную в физиологическом растворе натрия хлорида до концентрации (10⁸-10⁹) кл/мл, инкубировали при температуре (22±1)⁰ С втечение 40 мин с опытными образцами НчМе, остаточная концентрация которых в контактной смеси составляла 6,4 мкг/мл по Au и 28,8 мкг/мл по Ag. Установлено способность клеток Salmonella опытных штаммов активно связывать НчМе уже через 10 мин после контактирования, тогда как обычно среднее время аккумуляции наночастиц бакклетками составляет (30-40) мин.

Полученные электронно-микроскопические изображения указывают на штаммовую специфичность при взаимодействии клеток с НчМе, что коррелирует с особенностями энергетического метаболизма клеток Salmonella опытных штаммов. Так, наиболее активную аккумуляцию НчМе регистрировали для клеток S. Dublin 12 (выраженная электронная плотность изображений, обусловленная высоким количеством аккумулированных втечение 10 мин НчМе), при этом активность АТР-зы мембранной фракции S. Dublin 12 была увеличена в среднем в 6,9 раз по-сравнению с ее активностью у S. Typhimurium 16, S. Enteritidis 34 і М (р≤0,05).

Также было проведено культивирование клеток Salmonella опытных штаммов с Нч Au и Ag на МПБ втечение (30-40) мин при температуре (37±1)⁰ С, а в последующем – инкубацию в сахарозо-желатиновой среде Файдича (1:1), сублимационное высушивание с предварительным вымораживанием. Контролем служили лиофилизаты суспензий бакклеток без присутствия НчМе.

После регидратации лиофилизатов клеток, предварительно культивированных в присутствии Нч Au в диапазоне концентраций (0,15-0,97) мкг/мл, определено увеличение интенсивности накопления биомассы S. Typhimurium 16 и S. Enteritidis 34 в среднем на 27,8 %, что сопровождалось усилением активности мембранной АТР-зы и дыхательной активности в среднем на 27,5 % иа 14 % соответственно относительно контроля (р≤0,05).

Анализ полученных результатов свидетельствует, что Нч Ag в диапазоне концентраций (0,035-0,54) мкг/мл также можно рассматривать как потенциальные криопротекторы и стимуляторы накопления биомассы клеток S.Enteritidis 34 і М (до 21,4 %, (р≤0,05)) после их лиофилизации по характеру изменений физиолого-биохимических показателей. При этом, регистрировали увеличение регидности клеточной оболочки клеток таких штаммов, то есть снижение ее проницаемости.

Т. обр., следует подчеркнуть, что физиолого-биохимические механизмы репарационных процессов клеток Salmonella, предварительно культивированных в присутствии Нч Au и Ag, после их регидратации характеризуются усилением енергетического метаболизма, увеличением регидности клеточной оболочки, а также компенсаторным вмешательством природной АОС в регуляцию интенсивности процессов окисления липидов и белков в мембранах бакклеток (р≤0,05), что и сопутствует стимуляции ростовых свойств культур клеток данного виду.

Опытные образцы наночастиц обоих металлов в указанном диапазоне концентраций не приводили к интенсификации накопления биомассы клеток S. Dublin 12 в процесе репарации/восстановления их жизнедеятельности, но вызывали активацию энергетического обмена и стабилизацию уровня проницаемости оболочки, а также угнетение интенсивности процессов липопероксидации и окислительной модификации белков по уровню образования их продуктов и производных (р≤0,05), – особенно вследствие влияния Нч Ag. Установленные изменения приведенных показателей для клеток S. Dublin 12, вызванные процессами лиофилизации/регидратации, были более выраженными и физиологически затратными нежели у клеток штаммов S. Typhimurium и S. Enteritidis .

Предложенный способ получения биомассы промышленно значимых штаммов микроорганизмов с использованием наночастиц металлов найдет широкое внедрение и использование в биотехнологической отрасли при изготовлении иммунобиологических препаратов, сырьем для которых является качественная биомасса клеток сальмонелл, в частности, – при изготовлении вакцинных препаратов против сальмонеллеза животных и людей; сальмонеллезных антигенов в диагностических исследованиях.