Стрекаловский И

Стрекаловский И.В., Шабашева Л.В., Крылова Т.А., Голубенцева Ю.В., Попов В.Б.

Федеральное государственное унитарное предприятие «Научно-исследовательский институт гигиены, профпатологии и экологии человека» Федерального медико-биологического агентства, г. Санкт-Петербург

Разработка экспериментальных подходов к использованию эмбриональных мезенхимальных стволовых клеток для коррекции токсического поражения экстраэмбрионального васкулогенеза, первичного и вторичного кроветворения у крыс.

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) человека и мыши благодаря своим уникальным свойствам являются перспективным материалом для трансплантации их в поврежденные ткани и органы. ЭСК при культивировании in vitro способны дифференцироваться в различные клетки, имеющие специфические маркеры нейронов, глии, эндотелия, кератиноцитов, трофобластов, кардиомиоцитов, остеобластов, клеток крови, гепатоцитов, инсулин-продуцирующих клеток и некоторых других. Однако функциональная активность для большинства дифференцировок не доказана. Многие свойства ЭСК имеют общие черты с раковыми клетками, а механизмы самоподдержания, связанные с «бессмертием» стволовых клеток, до конца не изучены. Альтернативой использованию ЭСК могут быть мезенхимальные стволовые клетки (МезСК), а именно, мезенхимные клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток [1]. Такие линии имеют свойства эмбриональных стволовых клеток и мезенхимных. Получение таких клеток не связано с донором и может быть стандартизировано. Важными характеристиками МезСК, выделенных из ЭСК (ESC-MSC) являются отсутствие риска туморогенности и иммунного ответа при трансплантации. Эти черты делают привлекательной модель ESC-MSC для стволовой клеточной терапии. Многочисленные примеры использования мезенхимных клеток при повреждениях разной патологии в костной и хрящевой тканях, инфаркте миокарда, лечения ожогов, печени и других патологий говорят о положительном влиянии этих клеток и улучшении в клинической картине заболеваний. Терапевтический эффект при этом не всегда обусловлен специфической дифференцировкой вводимых клеток в поврежденные ткани. Продукция цитокинов и ростовых факторов стимулирует регенерацию тканей и улучшает функционирование органов.

Особенностью нашей работы являлась разработка экспериментальных подходов к использованию мезенхимальных стволовых клеток для коррекции токсического поражения эмбриональных тканей. К настоящему времени опубликованы лишь единичные работы по трансплантации СК на эмбриональных моделях с врождёнными отклонениями [2, 3], а попыток коррекции токсического поражения эмбрионов не предпринималось. Нами были выбраны две модели, отражающие поражение первичного (экстраэмбриональный васкулогенез в висцеральной стенке желточного мешка) и вторичного (печеночный эритропоэз в ранний плодный период) кроветворения.

Работа в рамках первой модели проводилась на культивируемых in vitro эмбрионах мыши и крысы начальных стадиий органогенеза (9,3-10,5 ДР), т.е. в период формирования в экстраэмбриональной мезодерме висцеральной стенки желточного мешка (ЖМ) кровяных островков и сосудов. Введение в культуральную среду 5-фторурацила в концентрации 0,2-0,4 мкг/мл приводило к заметному повреждению как сосудистой сети ЖМ, так и развития собственно эмбриона. Через 6-12 ч после поражения васкулогенеза, эмбрионы переносили в свежую культуральную среду без ингибитора и с целью неоваскуляризации экстраэмбриональной мезодермы ЖМ, в экзоцелом эмбриона с помощью микроинъектора Narishige IM-6 инъецировали примерно 10 000 меченных флуоросцеином РКН26 МезСК человека. По окончании культивирования эмбрионов (46-48 ч) оценивали их жизнеспособность по наличию или отсутствию кровообращения, степени развития сосудистой сети. Размещение и степень ассоциации мезенхимных клеток с мезодермой экзоцелома определялась с помощью флуоресцентного микроскопа. Было выявлено, что меченые мезенхимные клетки располагаются по направлениям сосудистой сети, скапливаясь на определенных участках. На других участках наблюдается или слабое фоновое свечение или яркое свечение единичных клеток. Данные результаты позволяют ответить утвердительно, что мезенхимные клетки, инъецированные в экзоцелом эмбриона крысы, располагаются не случайным (хаотичным) образом, а преимущественно по сосудистому руслу. Можно предположить, что более яркие скопления вдоль сосудов связаны с повреждением данных участков 5-фторурацилом.

Следующим этапом нашего исследования являлась коррекция поражения 5-фторурацилом гемопоэза печени плодов крысы мезенхимальными стволовыми клетками.

Известно, что вторичный (после кроветворения в ЖМ) процесс кроветворения происходит в печени в ранний плодный период. У эмбрионов крыс его наблюдают на 14-16-й день развития, когда в крови присутствуют эритробласты, как продуцированные в желточном мешке, так и в печени. Повреждение процессов кроветворения в печени приводит к нарушению оксигенации тканей, их гипоксии и анемии. В свою очередь гипоксия провоцирует индукцию аномалий развития и торможение роста плодов [4]. Для получения поражения гемопоэза печени эмбрионов крысы мы использовали данные Shuey et al., которые показали, что 5-ФУ при п/к введении крысам на 14-й ДБ в дозах 20-40 мг/кг активно воздействует на эмбриональный/плодный период эритропоэза, что приводит к анемии плодов. [5] Эти данные мы положили в основу модели, с помощью которой, вводя в кровяное русло подопытных плодов эмбриональные мезенхимные стволовые клетки, мы предполагаем получить восстановление кроветворной функции клеток печени и снизить повреждающее действие 5-ФУ.

Для этого группе самок крыс утром на 14-й ДБ п/к инъецировали 5ФУ в дозе 40 мг/кг, вечером того же дня, этим самкам под общим наркозом делали разрез в поясничной области, извлекали (не иссекая) часть матки с плодами и каждому эмбриону в детскую часть плаценты инъецировали 50 мкл (приблизительно 100 000 клеток), меченных витальным флуоресцеином PKH26, мезенхимных клеток, полученных из ЭСК мыши. На 16-й ДБ животных умерщвляли, из матки извлекали плоды, разрезали сосуды ЖМ и делали мазки крови. Анализ образцов крови 16 дневных плодов (т.е. через 48 ч после воздействия) выявил резкое увеличение численности ядерных эритробластов, происходящих из ЖМ. Содержание безъядерных клеток было существенно уменьшено. Все клетки были повреждены действием 5ФУ. Анализ образцов крови эмбрионов после введения МезСК, по сравнению с мазком после воздействия 5ФУ (но без инъекции МезСК) изменился значительно: статистически достоверно (P<0.05) уменьшилась численность эритробластов ЖМ и, в целом, клеток, содержащих ядра, появились молодые формы вторичных (печеночных) эритроидных клеток. Наблюдения образцов крови, проведенные с помощью флуоресцентного микроскопа, выявили присутствие в мазках крови плодов инъецированные в детскую часть плаценты меченые МезСК.

В целом, введение МезСК плодам, подвергнутым действию 5ФУ, по всей видимости, активизировало области кроветворения в печени плодов, что, вероятно, и привело к существенному улучшению клеточного состава мазка, который стал более приближен к контрольному составу (рис. 1). Таким образом, инъекция МезСК в детскую область плаценты 14-дневных плодов крысы привело к достоверной коррекции клеточного состава мазков их крови после повреждающего воздействия 5ФУ.

Основной задачей в данной работе было оценить роль трансплантации МезСК в коррекции токсических поражений тканей и органов животных на эмбриональных моделях:

$C:\Users\Стрекаловский\Desktop\3.png$ 251660288 Рис. 1 Коррекция гемопоэза печени 14-16-дневных плодов крысы мезенхимными клетками человека после воздействия 5-фторурацилом

1) поражение экстраэмбрионального васкулогенеза крыс с последующим его ремоделированием; 2) нарушение печеночного кроветворения в ранний плодный период крыс. Полученные данные свидетельствуют, что введения МезСК после поражения той или иной ткани приводит к определеному снижению токсических проявлений поражения, к активизации (потенцированию) собственных ресурсов пораженной ткани, направленных на восстановительные процессы.

Литература

1. Dennis J. E. ,Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma// Stem Cells. -2002. - Vol.20. – P. 205-214.

2. Le Blanc K. et al. Fetal mesenchymal stem-cell engraftment in bone after in utero transplantation in a patient with severe osteogenesis imperfecta // Transplantation.- 2005.- 79(11). - P. 1607-14.

3. Guillot P.V. et al. Intrauterine transplantation of human fetal mesenchymal stem cells from first-trimester blood repairs bone and reduces fractures in osteogenesis imperfecta mice// Blood.- 2008.- 111. - P. 1717-1725.

4. Shepard Thomas H, Ronald J. Lemire Catalog of Teratogenic Agents //J.Hopkins found.., NY.,-2005. – P.1-528.

5. Shuey DL; Zucker RM; Elstein KH; Rogers J. M. Fetal anemia following maternal exposure to 5-fluorouracil in the rat// Teratology.- 1994.- 49(4). - P. 311-319.