И.В. Манжуло, О.С. Огурцова, И.В. Дюйзен

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Россия

Аналгетический эффект докозагексаеновой кислоты у крыс с моделью нейрогенного болевого синдрома

В эксперименте на белых крысах показано, что перевязка седалищного нерва сопровождается развитием нейропатического болевого синдрома – у животных снижается порог температурной болевой чувствительности, формируется неравномерное распределение веса на задние конечности, а также возникают дистрофические нарушения в тканях стопы. Использование докозагексаеновой кислоты у животных с повреждением седалищного нерва дозо-зависимо (и в большей мере, чем препарат сравнения диклофенак) снижает активность и сроки реализации нейрогенного болевого синдрома, приводит к более ранней стабилизации распределения веса и препятствует развитию дистрофических изменений в тканях стопы.

Ключевые слова: докозагексаеновая кислота, нейропатический болевой синдром, крысы.

Введение

Проблема терапии нейропатической боли на сегодняшний день является объектом пристального изучения во всем мире. Последние исследования в этой области предлагают несколько методик, направленных на борьбу с нейрогенными болевыми синдромами [4]. Одно из направлений лечения нейропатической боли основано на роли полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) в нервной ткани. Показано, что жирные кислоты этой группы способны оказывать прямое стабилизирующее воздействие на мембрану клеток, делая ее более устойчивой к повреждающим воздействиям, с одной стороны, и более податливой для проведения нервного импульса – с другой [6].

Кроме того, действие ПНЖК в нервной ткани опосредуется влиянием на синтез, метаболизм, везикулярный транспорт и рецепторные эффекты нейротрансмиттеров, нейромодуляторов и сигнальных молекул. Полиненасыщенные жирные кислоты могут непосредственно или косвенно модулировать неврологическую активность на различных уровнях [5]. Значительный интерес представляет докозагексаеновая кислота (ДГК), выраженные антиболевые эффекты которой были зарегистрированы на некоторых моделях острой боли [1, 12]. В настоящем исследовании мы определяли особенности реализации антиболевого эффекта ДГК у крыс с моделью хронической нейропатической боли.

Материалы и методы

Работа выполнена на самцах крыс средним весом 250 г., содержащихся в стандартных условиях вивария. Исследование проводили в соответствии с Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.). Животных содержали в виварии в соответствии с «Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» (от 06.04.1993 г.). Животные получали стандартную диету (корм для лабораторных мышей и крыс ЗАО «БиоПро») следующего состава: протеин (21.5%), клетчатка (4%), метионин + цистеин (0.8%), Ca (1%), P (0.4%), NaCl (0.35%), калорийность не менее 13.2 МДж/кг.

Для моделирования нейропатического болевого синдрома под эфирным наркозом проводили наложение 3 лигатур на седалищный нерв [3]. Животные были разделены на пять групп (по 8 животных в каждой) – группа «контроль», группа «боль» - с моделью нейропатической боли, группа «ДГК45» - животные с травмой, получающие ДГК в дозе 45 мг/кг, группа «ДГК4.5» - животные с травмой, получающие ДГК в дозе 4.5 мг/кг и группа «диклофенак» - животные с травмой, получающие 4мг/кг диклофенака (Indus Pharma Pvt. Ltd., India) - препарат сравнения. Все препараты вводили внутримышечно в течение 2 недель после операции.

Развитие болевого синдрома у животных с поврежденным периферическим нервом сопровождается появлением ряда патологических симптомов, поддающихся количественной оценке и свидетельствующих об интенсивности боли. Мониторинг патологических изменений осуществляли с использованием специализированного оборудования. Распределение нагрузки на задние конечности исследовали с помощью тестера инвалидности (Columbus Instruments, USA). Данный тест позволяет оценить выраженность болевого синдрома в поврежденной лапе по характеру распределения веса на задние конечности при неподвижном положении животного в камере наблюдения [13]. Данные о распределении веса на правую и левую конечности (в граммах) выражали в процентах от общего веса животного. У интактных животных этот показатель находится в пределах 50:50%, а развивающийся при повреждении периферического нерва болевой синдром сопровождается уменьшением нагрузки на поврежденную конечность. Hot-cold-plate-анализатор (Columbus Instruments, USA) использовали в настоящем исследовании для оценки холодовой аллодинии, неизменно сопровождающей развитие нейрогенного болевого синдрома [3]. Тест проводили в камере с акриловыми стенами высотой 30 см на охлажденной до 0^оС металлической пластине размером 30х30 см. Интактные животные в течение длительного времени способны выдерживать данную температуру, опираясь всеми конечностями на охлажденный пол. При повреждении нерва время контакта конечности с холодной пластиной значительно сокращается. Для количественной оценки данного параметра регистрировалось время удержания конечности на весу в течение 1 минуты пребывания животного в тест-камере. Все функциональные тесты проводились на 5, 9, 13, 17 сутки после операции; каждое животное тестировалось трижды с интервалом в 5 минут между измерениями. Полученные данные обрабатывали с использованием пакета программ “Statistica 6.0”. Достоверность различий (при р<0.05) оценивали по t критерию Стьюдента.

Результаты

В тесте распределения нагрузки на задние конечности у животных с нейропатическим болевым синдромом возникает асимметрия в удержании веса тела с более активным использованием интактной конечности [13]. Данный показатель в разные послеоперационные сроки имел достоверные отличия у животных всех экспериментальных групп. Животные в группе «боль» уже через 5 суток после повреждения нерва 69.9±1.8% собственного веса удерживали интактной конечностью. В этот же период животные группы «ДГК45» распределяют вес практически симметрично (55.4±2%:44.6±2%) с предпочтительным использованием неповрежденной лапы, в группе «ДГК4.5» - 70.7±1.57%:29.3±1,57%, а в группе «диклофенак» - 66.4±2.36%:33,6±2.36%. В дальнейшем у животных всех групп формируется тенденция к снижению доминирования упора на здоровую конечность, к концу эксперимента распределение веса у животных группы «боль» составляет 65.3±2.4%:34.7±2.4%, в группе «ДГК45» животные полностью восстанавливают баланс распределения веса, тогда как распределение веса в группе «ДГК4.5» и «диклофенак» составляет 61.4±2%:38.6±2% и 56.6±2.35%:43.4±2.35% соответственно (Рис. 1).

Рис. 1 Динамика распределения веса на задние конечности у животных с моделью нейропатической боли (А), при использовании диклофенака (4 мг/кг) (Б), ДГК (4.5 мг/кг) (В) и ДГК (45 мг/кг) (Г), пунктир – контроль. Данные представлены как M±m, %, где m – стандартная ошибка среднего. *Достоверные различия между значениями интактной и поврежденной конечности (p<0.05).

Развитие холодовой аллодинии характеризует наличие и степень развития нейрогенного болевого синдрома и основывается на феномене снижения порога возбуждения рецепторов на воздействие неболевых термических стимулов [3]. Результаты проведенного теста в группе «боль» демонстрируют появление данного синдрома уже на 5 сутки после операции (8.5±0.39 секунд) и его резкое нарастание к 9-13 суткам. Лишь к концу наблюдения отмечалась тенденция к снижению этого показателя до 14.75±0.61 секунд. У животных группы «ДГК45» начальные признаки развития холодовой аллодинии регистрировались позже - на 9 сутки (9±1.31 секунд), и сохранялись на данном уровне вплоть до конца наблюдения, тогда как у животных группы «ДГК4.5» аллодиния отсутствовала. В группе «диклофенак» признаки аллодинии возникали уже на 5 сутки, и нарастали к 13-17 дню наблюдения (Рис. 2).

Рис. 2 Выраженность холодовой аллодинии (время отсутствия контакта с охлажденной пластиной) у животных при повреждении седалищного нерва и использовании диклофенака (4 мг/кг), ДГК (4.5 мг/кг), ДГК (45 мг/кг). Данные представлены как M±m, секунд, где m – стандартная ошибка среднего. *Достоверные различия между значениями группы «боль» и животными групп «ДГК45», «ДГК4.5» и «диклофенак» (p<0.05).

Также необходимо отметить, что у 60% крыс из группы «боль» за период наблюдения были выявлены признаки обширных трофических повреждений стопы и явление аутотомии одного или нескольких пальцев травмированной конечности. У животных групп «ДГК45», «ДГК4.5» и «диклофенак» описанных патологических изменений не наблюдалось. Зарегистрированные на 6-10 сутки незначительные изъязвления кожи поврежденной лапы, спонтанно рубцевались и эпителизировались.

Обсуждение

В настоящее время механизмы нейропротективного и антиболевого эффектов ДГК активно исследуются. Наиболее широко изучены антивоспалительные и антиоксидантные эффекты препарата [1, 4], приводящие к уменьшению инициирующего боль воспалительного процесса в периферических тканях. Кроме того, ДГК, встраиваясь в мембраны нейронов и глиальных клеток, модулирует их метаболические, электрические и рецепторные свойства [2]. Эндогенные метаболиты ДГК (нейропротектин D1 и резолвины) уменьшают выраженность некроза и апоптоза тканевых элементов центральной и периферической нервной системы [10, 11, 15]. ДГК является основным компонентом фосфолипидов мембран нейронов, где выполняет структурную и функциональную роль [7]. Состояние мембран нейронов имеет решающее значение для передачи нейрональной информации и ионного обмена между внутренней и внешней сторонами мембраны [14]. На сегодняшний день известно, что комплексы жирных кислот отдельных регионов мозга в разной степени страдают от недостатка ДГК в процессе развития [10]. Последние данные указывают на то, что в дополнении к описанным эффектам ДГК оказывает нейропротекторное воздействие на нервную ткань при хронических дегенерационных процессах [5]. Проведены исследования, результаты которых демонстрируют тот факт, что использование ДГК после травмы спинного мозга значительно повышает выживаемость нейронов и улучшает локомоторные и двигательные функции [8]. В спектре эффектов ДГК выявлены также специфические нейротрансмиттерные взаимодействия, обеспечивающие подавление болевого сигнала – уменьшение продукции вещества Р ноцицептивными нейронами (собственное неопубликованное наблюдение) и активация эндогенных опиоидных [12] и неопиоидных [9] механизмов аналгезии. Детальное изучение особенностей и механизмов антиболевого действия эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот необходимо для разработки новых фармакологических стратегий регуляции болевого синдрома.

Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение 14.132.21.1344 и ДВО РАН, гранты 12-III-А-06-090; 12-I-П7-02; 13-III-В-06-020; 13-III-В-06-035.

Литература:

1. Bazan N.G. // Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 2007. Vol. 10. P. 136-141.

2. Belayev L., Marcheselli V.L., Khoutorova L. et al. // Stroke. 2005. Vol. 36. P. 118-123.

3. Bennett G.J. // Muscle Nerve. 1993. Vol. 16. P. 1040- 1048.

4. Cunnane S.C., Plourde M., Pifferi F. et al. // Prog. in Lipid Res. 2009. Vol. 48. P. 239-256.

5. Dyall S.C., Michael-Titus A.T. // Neuromol. Med. 2008. Vol. 10. P. 219-235.

6. Farooqui A.A., Horrocks L.A., Farooqui T. // J. Neurochem. 2007. Vol. 101. P. 577-599.

7. Gamoh S., Hashimoto M., Sugioka K., Hossain M., Hata N., Misawa Y., Masumura S. // Neuroscience. 1999. V. 93. P. 237-241.

8. King V.R., Huang W. // The J. of Neurosci. 2006. V.26. № 17. P. 4672-4680.

9. Mathieu G., Denis S., Langelier B. et al. // Neurochem. Int. 2010. Vol. 56. P. 94-100.

10. Mukherjee P.K, Chawla A., Loayza M.S. et al. // Prostagland. Leuk. Essent Fat. Ac. 2007. Vol. 77. P. 233-238.

11. Nakamoto K., Nishinaka T. et al. // Biol. Pharm. Bull. 2010. Vol. 33, № 6. P. 1070-1072.

12. Nakamoto K., Nishinaka T. et al. // Europ. J. of Pharm. 2011. Vol. 666. P. 100-104.

13. Nakazato-Imasato E., Kurebayashi Y. // Life Scienc. 2009. Vol. 84. P. 622-626.

14. Rodriguez T., Belayev E.B., Liu L., Busto Y., Parkins R., Bazan N. // J. of Neurochem. 2002. V. 83. P. 515-524.

15. Serhan C.N., Gotlinger K., Hong S. et al. // J. Immunol. 2006. Vol. 176. P. 1848-1859.