Биологические науки/9. Биохимия и биофизика

К.б.н. Буренина Э.А.

Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток

Активность и свойства фосфатаз цестоды Bothriocephalus scorpii.

Богатство и лабильность путей углеводного обмена гельминтов не является неожиданностью, они легко объясняются адаптациями, сопровождавшими возникновение явления паразитизма у червей, и логично укладываются в схему биохимической эволюции животных. Адаптация гельминтов к паразитическому образу жизни изменила соотношение затрат энергии на различные функции. У паразитических стадий развития гельминтов отсутствуют затраты на поддержание температуры тела, так как они имеют температуру тела хозяина. Энергетические расходы на мышечную деятельность тоже невелики, так как они ведут малоподвижный образ жизни. Большая часть энергии расходуется на биосинтезы, поддержание градиентов и другие процессы жизнедеятельности, особенно во время быстрого роста на отдельных стадиях развития и в период яйцепродукции. Среди органических соединений, входящих в состав живого организма, чрезвычайно важное место занимают сложноэфирные производные фосфорных кислот, выполняющие различные жизненно важные функции и играющие огромную роль в клеточном метаболизме. К этим соединениям относятся щелочные фосфатазы (ЩФаза, НФ 3.1.3.1.), имеющие щелочной оптимум и кислые фосфатазы (КФаза, НФ 3.1.3.2.), имеющие кислый оптимум. Эти фосфатазы обладают очень широким спектром видо- и тканекспецифичности и обнаружены у самых разных биологических объектов, начиная от примитивного одноклеточного до чрезвычайно сложно организованного млекопитающего. Превращение пирувата в глюкозу является центральным путем глюконеогенеза. Последней необратимой ступенью глюконеогенеза является образование глюкозы из глюкозо-6- фосфата, осуществляемое при участии глюкозо-6-фосфатазы (Г-6-Фазы, НФ 3.1.3.9). Обходной путь, который катализирует практически необратимый гидролиз фруктозо-1,6-бисфосфата, действует с участием фермента фруктозобисфосфатазы (ФБФаза, НФ 3.1.3.11) , являющегося ключевым ферментом глюконеогенеза.

Целью настоящей работы является изучение активности и свойств Г-6-Фазы, ФБФазы, кислой и щелочной фосфатаз в различных субклеточных фракциях у цестод Bothriocephalus scorpii из отряда Pseudophyllidea Carus, 1963, сем. Bothriocephalidae Blanch, 1849, паразитирующих в пилорических придатках бычка Брандта Myoxocephalus brandti из залива Петра Великого.

Глюкозо-6-фосфатаза. Исследовано распределение Г-6-Фаз по субклеточным фракциям, наибольшая активность локализована в митохондриальной фракции B.scorpii (табл.1), оптимум активности находится в области рН 7.2. Г-6-Фаза, являясь металлопротеином, требует обязательного присутствия иона Mg²⁺. Изучая влияние концентрации Mg²⁺ на активность фермента, обнаружили, что насыщение среды инкубации наступало в микросомальной фракции при 6 мМ, а в митохондриальной - при 8 мМ. Согласно литературным данным, для определения Г-6-Фазы в личинках и взрослых Ascaris lumbricoides было необходимо 5 мМ Mg²⁺, а в Ascarida galli, Setaria cervi и Litomosoides carinii - 10 мМ Mg²⁺ (1, 2). Скорость Г-6-Фазной реакции растет с увеличением количества добавленного субстрата, оставаясь постоянной при концентрации его в пробе митохондриальной фракции 70 мМ, а в микросомальной фракции 80 мМ.

Табл.1.

Распределение фосфатаз Bothriocephalus scorpii по субклеточным фракциям (в нмолях Р/мин/мг белка)

Исследуемая фракция	Активность
	Г-6-Фаза	ФБФаза	КФаза	ЩФаза
Цитозоль 12 тыс. g	7.12±0.7	149.7±6.2	25.6±0.4	13.8±0.8
Митохондрии	26.40±3.5	46.0±1.9	30.8±3.5	37.9±0.9
Цитозоль 105 тыс.g	5.59±0.3	446.8±76.0	29.0±2.6	17.0±0.5
Микросомы	8.60±1.1	539.1±70.4	31.5±2.1	17.0±1.0

Для анализа свойств Г-6- Фазы было исследовано влияние различных эффекторов на активность фермента B.scorpii. Глюкоза, являясь конечным продуктом Г-6-Фазной реакции, активирует митохондриальную (+56%) и микросомальную (+3.4%) Г-6-фосфатазу B.scorpii. NaF в концентрации 2 мМ активирует митохондриальную на 10.5% и ингибирует микросомальную Г-6-Фазу на 15.8%. При введении аниона НСО^-₃ в концентрации 20 мМ в инкубационную среду увеличивалась активность Г-6-Фазы в митохондриальной фракции на 132%, а в микросомальной - на 45%. Цитрат в концентрации 10мМ угнетал активность митохондриального фермента на 46.3%, а микросомального - на 36%. В связи с тем, что двухвалентные катионы являются ингибиторами Г-6-Фазы, интересно было посмотреть влияние Сu²⁺ (10 мМ) на активность фермента B.scorpii. Катион Сu²⁺ ингибирует Г-6-Фазу в митохондриальной фракции на 9.5%, в микросомальной - на 22,6%. Дитиотрейтол (ДТТ) в концентрации 0.1 мМ активировал митохондриальную Г-6-Фазу B.scorpii на 50.7%, но ингибировал микросомальную на 11.3%. ЭДТА оказывает специфическое действие на мембранные структуры, что, видимо, объясняется образованием комплексов с двухвалентными катионами. ЭДТА в концентрации 1 мМ угнетает и митохондриальные (41%) и микросомальные (34%) Г-6-Фазы B.scorpii.

Подводя итог проведенным экспериментам, можно сказать, что митохондриальные и микросомальные фракции B.scorpii обладают Г-6-Фазной активностью.

Фруктозобисфосфатаза. Исследовано распределение фермента по субклеточным фракциям, наибольшая активность ФБФазы была локализована в митохондриальной и микросомальной фракциях, из цитозольных фракций - в цитозоле 12 000g в присутствии Mg²⁺ (табл.1). Отчетливый максимум ФБФ азной активности во всех субклеточных фракциях B.scorpii находится в области рН 8.0. Реакция требует присутствия двухвалентных катионов (Mg²⁺ или Mn²⁺). У B.scorpii в цитозолях 12 000 g и 105 000 g насыщение ионами Mg²⁺ наступало при 2.5 мМ, ионами Mn²⁺ - при 8 мМ; в митохондриях и микросомах насыщение Mn²⁺ наступало при 0.01 мМ, а насыщение Mg²⁺ - при 0.25 и 0.3 мМ соответственно. По данным литературы, ФБФазу у гельминтов S.cervi, A.lumbricoides, Moniezia expansa, Dicrocoelium dendriticum и др. изучали в основном с добавлением иона Mg²⁺ (2-5). В самках, самцах и личинках 3-й стадии Bunostomum trigonocephalum (6) фермент изучали с ионами Mg²⁺ и Mn²⁺.

Скорость энзиматической реакции зависит от концентрации субстрата, которым служит фруктозобисфосфат (ФБФ). Скорость реакции растет с количеством добавленного субстрата, оставаясь постоянной при концентрации 40 мМ во всех субклеточных фракциях с ионами Mg²⁺ и Mn²⁺.

Изучая свойства ФБФаз B.scorpii, исследовали влияние различных эффекторов и катионов на активность этого фермента. Было исследовано влияние одновалентных катионов ( K⁺, Na⁺, Li⁺, NH₄⁺) на активность ФБФаз во всех субклеточных фракциях B.scorpii. Катион Li⁺ ингибировал активность фермента во всех фракциях, катионы Na⁺ и К⁺ - в цитозолях 12 000 g и 105 000 g, катион NH⁺₄ - в цитозоле 105 000 g и микросомах. Наши данные согласуются с данными, полученными для энзима из летательной мышцы водяного клопа, саранчи, мышцы ноги таракана и лягушки (7).

Двухвалентные катионы Cu²⁺ и Zn²⁺ ингибировали активность ФБФаз в B.scorpii во всех субклеточных фракциях в реакциях с Mg²⁺ и Mn²⁺. Наши данные согласуются с данными, полученными на летательной мышце шмеля Bumble-Bee (7). Фторид натрия и ЭДТА ингибировали фермент во всех субклеточных фракциях в реакциях с Mg²⁺ и Mn²⁺. Парахлормеркурибензоат (П-хмб), являясь ингибитором сульфгидрильных групп ферментов, ингибировал фермент из B.scorpii, но не значительно. Дитиотрейтол(ДТТ), являясь сульфидрильным реагентом, ингибировал ФБФазу в цитозоле 105 000g, митохондриях и микросомах в реакции с Mg²⁺ , в цитозоле 12 000g в реакции с Mn²⁺, а в остальных фракциях активировал. Цитрат ингибировал активность фермента во всех фракциях B.scorpii, кроме фермента цитозоля 105 000g в реакции с Mn²⁺.

Подводя итог проведенным экспериментам, можно сделать вывод, что все субклеточные фракции B.scorpii обладают ФБФазной активностью. Особенности свойств ФБФазы тканей B.scorpii свидетельствуют о наличии активного глюконеогенеза, объединенного регуляторными системами с циклом трикарбоновых кислот, гликолизом и системой окисления жирных кислот.

Кислая и щелочная фосфатазы. Активности КФаз и ЩФаз были исследованы во всех субклеточных фракциях, наибольшая активность наблюдается в митохондриальных фракциях (табл. 1). Широкое распространение кислых и щелочных фосфогидролаз в органах и тканях гельминтов свидетельствует об их важной физиологической роли. Отчетливый максимум КФазной активности во всех субклеточных фракциях B.scorpii находится в области рН 5.8, а ЩФазной активности - в области рН 8.3. Активность фосфатаз результируется в высвобождении ионов фосфора, которые могут быть использованы в других путях обмена. Скорость энзиматической реакции зависит от концентрации субстрата, которым служит Na-β-глицерофосфат. Скорость КФазной реакции растет с увеличением количества добавленного субстрата, оставаясь постоянной при концентрации его в пробе 80 мМ в микросомальной фракции, 90 мМ - в цитозоле 12 000g, 100 мМ - в митохондриях и 120 мМ - в цитозоле 105 000g; для ЩФазы - 80 мМ в цитозоле 105 000g , а в остальных фракциях - 100 мМ Na-β-глицерофосфата. Насыщение КФаз и ЩФаз Na-β-глицерофосфатом у 7 видов Monogenea и 8 видов Digenea (8) происходило при 10 мМ, у Schistosoma mansoni (9), Dirofilaria immitis и Angyostrongylus cantonensis (10) - при 100мМ, а у 8 видов трематод (11) - при 142,3 мМ.

Для анализа свойств кислой и щелочной фосфатаз было изучено влияние различных эффекторов и катионов на активность этих энзимов. Изучая влияние одновалентных катионов (Na⁺ и К⁺) на активность ЩФазы, обнаружили, что фермент был ингибирован во всех субклеточных фракциях. Фтористый натрий, являясь классическим ингибитором ферментов, ингибирует обе фосфатазы B.scorpii во всех субклеточных фракциях. Наши данные согласуются с данными, полученными на других гельминтах (9, 10, 12-15).

Исследуя влияние двухвалентных катионов на активность ЩФазы B.scorpii, обнаружили, что ионы Ca²⁺, Ba²⁺,Zn²⁺, Cu²⁺ и Mg²⁺ активировали фермент, кроме цитозоля 105 000g, фермент которого был ингибирован ионом Ca²⁺, а митохондриальный фермент был ингибирован ионом Mg²⁺ . Самым сильным активатором был катион Zn²⁺, видимо, потому, что ЩФаза является Zn²⁺-содержащим ферментом и дополнительное введение катиона Zn²⁺ привело к сильному активированию фермента. Катионы Zn²⁺ в концентрации 10 мМ также активировали КФазу B.scorpii, а КФазы Gastrothylax crumenifer, Gastrodiscus aegyptiacus, D.immitis и A.cantonensis (11,13,14) были ингибированы ионами Zn²⁺. КФаза B.scorpii была ингибирована ионами Mg²⁺ в трех фракциях, кроме 105 000g цитозоля, а Щфаза была активирована в трех фракциях, кроме митохондриальной. Ион Cu²⁺ ингибировал КФазу, кроме микросомальной фракции, а ЩФаза была активирована во всех фракциях. Ион Са²⁺ ингибировал КФазу в цитозольных фракциях, но активировал в митохондриях и микросомах, а ЩФаза была активирована в трех фракциях, кроме цитозоля 105 000 g . Наши данные согласуются с данными, полученными для D.immitis и A.cantonensis (10), G. aegyptiacus (13), G.crumenifer (12). ЭДТА, являясь хелатирующим агентом, угнетает активность КФазы и ЩФазы во всех фракциях. Такой же эффект был обнаружен и при изучении ферментов G.aegyptiacus (13) . Цистеин ингибировал ЩФазу B.scorpii во всех фракциях, а КФазу - в трех фракциях, кроме микросомальной. Согласно литературным данным КФазы C.sinensis и S.mansoni (9) были активированы цистеином, а ЩФазы спороцист и церкарий S.mansoni и цестод R.johri (15) ингибированы цистеином. ПХМБ ингибировал кислую и щелочную фосфатазы во всех фракциях B.scorpii. Наши данные согласуются с данными, полученными для S.mansoni (9). 2,4 - Динитрофенол, являясь ингибитором фосфорилирования и индуцированного синтеза ферментов, ингибировал кислую и щелочную фосфатазы B.scorpii во всех субклеточных фракциях. Арсенат натрия активирует ЩФазу B.scorpii во всех фракциях. Это не согласуется с данными, полученными для восьми видов трематод, занимающих одинаковую среду обитания, фермент был ингибирован арсенатом натрия в концентрации 10^-3 M в пределах 13.9-41,9% (11). Молибдат аммония ингибировал ЩФазу B.scorpii во всех фракциях. α-фенилаланин и дитиотрейтол ингибировали ЩФазу B.scorpii во всех фракциях. Данных о влиянии этих препаратов на ЩФазу беспозвоночных не встречали.

Подводя итог проведенным экспериментам, можно сделать вывод, что все субклеточные фракции B.scorpii обладают КФазной и ЩФазной активностями. Полученные результаты и литературные данные демонстрируют, что кислая и щелочная фосфатазы присутствуют в различных мышцах и органах разных представителей беспозвоночных и аналогичны свойствам ферментов из позвоночных.

Литература

1. Srivastava V.M.Z., Ghatak S., Krishna Murti C.R. Ascarida galli: lactic acid production, glycogen content, glycolytic enzymes and properties of purified aldolase, enolase and glucose-6-phosphate degydrogenase // Parasitol. 1970. V. 60. N 2. P. 157-180.

2. Anwar N., Ansari A.A., Ghatak S., Krishna Murti C.R. Setaria cervi: enzymes of glycolysis and PEP-succinate // Z. Parasitenkd. 1977. V. 51, N 2. P. 275-283.

3. Barrett J., Ward C.W., Fairbairn D. The glyoxylate cycle and the conversion of triglycerides to carbohydrates in developing eggs of Ascaris lumbricoides // Comp. Biochem. Physiol. 1970. V.35. N 3. P. 577-586.

4. Kohler P., Hanselmann K. Intermediary metabolism in Dicrocoelium dendriticum (Trematoda) // Comp. Biochem. Physiol. 1973. V. 45 B. N 4. P. 825-845.

5. Behm C.A., Bryant C. Studies of regulatory metabolism in Moniezia expansa: general considerations // Int. J. Parasitol. 1975. V. 5. N 2. P. 209-217.

6. Kumar S. Bunostomum trigonocephalum: the in vitro effects of anthelmintics on the enzyme activities // Helminthol. 1987. V. 24, N 2. P. 133-140.

7. Newsholme E.A., Crabtree B., Higgins S.J., Thornton S.D., Carole Start. The activities of fructose diphosphatase in flight muscles from the Bumble-Bee and the role of this enzyme in heat generation // Biochem. J. V. 128. N 1. P. 89-97.

8. Halton D.W. Studies on phosphatase activity in trematoda // J. Parasitol. 1967. V. 53. N 1. P. 46-54.

9. Ernst S.C. Biochemical and cytochemical studies of digestive-absorptive of esophagus, caecum and tegument in Schistosoma mansoni: acid phosphatases and tracer studies // J. Parasitol. 1975. V. 61. N 4. P. 633-647.

10. Maki J.,Yanagisawa T. Histochemical studies on acid phosphatase of the body wall and intestine of adult filarial worms in comparison with that of other parasitic nematodes// J. Helminthol. 1980. V. 54. N 1. P. 39-41.

11. Nizami W.A., Siddiqi A.H., Yusufi A.N.K. Non-specific alkaline phosphomonoesterases of eight species of digenetic trematodes // J. Helminthol. 1975. V. 49. N 4. P. 281-287.

12. Gupta V., Agarwal S.K. Phosphatase activity in Gastrothylax crumenifer (Trematoda) // Indian J. Parasitol. 1979. V. 3. N 1. P. 53-55.

13. Gupta S.P., Gupta R.S. Phosphatase activity in Gastrodiscus aegyptiacus (Trematoda) // Indian J. Parasitol. 1978. V. 2. N 1. P. 61-63.

14. Rao L.N., Simha S.S. Phosphatases and polyphenol oxidase in three trematodes of Rana tigrina // Helminthologia, Bratislava. 1979. V. 16. N 1. P. 63-71.

15. Roy T.K. Histochemical studies on Raillietina (Raillietina) johri (Cestoda: Davaineidae). I. Non-specific and specific phosphatases // J. Helminthol. 1979. V. 53. N 1. P. 45-49.